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Epizootiologie von Q-Fieber bei Wiederkäuern und wild lebenden Säugetieren und differenzierende molekulare Pathogenese von Coxiella burnetii bei Mensch und Tier

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: FLI-IBIZ-08-HV-0006
Laufzeit: 01.08.2007 - 30.07.2013
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Coxiella burnetii ist ein obligat intrazellulär lebender Erreger. Seine genetische Ausstattung erlaubt es ihm, sich in seinem Wirt zu replizieren und sich effektiv durch Inhibition der Immunantwort der Abwehr durch die Wirtszelle zu entziehen. Die Sequenzierung des Referenzstamms RSA493, eines virulenten Phase I Isolates, zeigte, dass C. burnetii über ein bisher nur von Legionella pneumophila bekanntes TypIV Sekretionssystem (T4SS) verfügt. Dieses T4SS ist bei L. pneumophila essentiell für die Pathogenität des Erregers und es wird davon ausgegangen, dass es für die Sekretion von Virulenzfaktoren verantwortlich ist, welche die Zellfunktion des Wirtes beeinflussen und das Überleben und die Vermehrung des Erregers ermöglichen. Die Natur dieser Virulenzfaktoren von C. burnetii ist bisher jedoch unbekannt. Um neue Virulenzfaktoren zu identifizieren sowie eine Verbesserung der Diagnostik und der Typisierung von C. burnetii Isolaten zu ermöglichen, ist die Sequenzierung der Genome von weiteren C. burnetii-Stämmen notwendig. In einem ersten Arbeitssschritt werden die Genome und die eventuell vorhandenen Plasmide von zwei C. burnetii-Isolaten sequenziert werden. Die zu sequenzierenden Isolate stammen aus den Q-Fieberausbrüchen in Nordrhein-Westfalen und dem süddeutschen Raum (also den bekannten epizootischen Gebieten). Die Sequenzierung erfolgt mittels Pryosequencing auf einem Genome Sequencer 20 System der Firma Roche, der am Hauptsitz des FLI auf der Insel Riems zur Verfügung steht. Das Contig-Assembly der Pryosequenzierungs-Sequenzen mit Annotation, die Entwicklung von molekularen Typisierungssystemen und die Identifizierung von Virulenzfaktoren werden am Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr München durchgeführt. In einem zweiten Arbeitschritt werden C. burnetii-Feldisolate und Isolate der einzelnen Verbundpartner durch Phänotypisierung, Multi Locus Sequence Typing (MLST) sowie Multi Locus VNTR Analyse (MLVA) charakterisiert. Dazu wird das Programm BioNumerics?, Applied Maths (Sint-Martens-Latem, Belgien) verwendet, das als State-of-the-art-Technologie für derartige Anwendungen gilt. Eine internationale Vergleichbarkeit der Daten ist so gewährleistet. Die Arbeitsgruppe am FLI übernimmt dann als Dienstleister die molekulare Typisierung von Isolaten aus Proben und Organmaterialien (Plattform ?Molekulare Typisierung?). Die Arbeitsgruppe am FLI, Jena, verfügt auch über Erfahrungen bei DNA-Manipulations-Techniken, des Sondendesigns sowie der Konzeption und Durchführung von Mircoarray-basierenden Hybridisierungsexperimenten. Deshalb werden in einem dritten Arbeitsschritt für ein besseres Verständnis der Pathogenese von C. burnetii Virulenzfaktoren durch Transkriptionsanalysen untersucht. Hierfür wird die mRNA aus dem Probenmaterial gewonnen, revers-transkribiert und die cDNA mit einem AT-Microarray analysiert. Die Ergebnisse der Hybridisierungsexperimente mit dem Microarray, auf dem alle identifizierten Virulenzfaktoren in Form von DNA-Oligo-Sonden repräsentiert sind, dienen dann zur Generierung von Expressionsprofilen. Als Probenmaterial können sowohl infizierte Zelllinien für in vitro-Experimente als auch Organmaterial aus Infektionsexperimenten mit Schafen und optional Blutproben von Patienten mit einer persistierenden Coxiellen-Infektion für in vivo-Experimente verwendet werden. Gegebenenfalls werden auf dem gleichen Chip parallel bekannte Gene aus der Abwehrkaskade des Wirtes mitanalysiert. Das Design und die Fertigung der AT-Microarrays erfolgt in Zusammenarbeit mit der Clondiag Chip Technologies GmbH. So entsteht die Plattform ?Molekulare Pathogenese?.

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