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Freisetzung bioaktiver Peptide aus Milchprotein durch proteolytische Enzyme von Milchsäurebakterien und Klonierung und Expression zweier zellwandgebundener Proteasen (Teilprojekt LactoMic)

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-MBT-08-KI-701-1050LactoMic
Laufzeit: 01.04.2010 - 30.04.2015
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Fermentationsmikroorganismen kommen in einer Gesellschaft, in der Lebensmittel immer hygienischer und damit keimfreier produziert werden, eine zunehmende Bedeutung zu. Durch Entwicklung neuer fermentierter Produkte mit bisher noch nicht zu Fermentationen eingesetzten Mikroorganismen, wird dem Bedarf an solchen Mikroorganismen Rechnung getragen. Als Mikro-organismen mit hohen Nährstoffansprüchen, die z.B. einige Aminosäuren nicht selbst synthetisieren können, besitzen Milchsäurebakterien (MSB) ein proteolytisches System, welches im Prinzip aus einer zellwandgebundenen, extrazellulären Protease, verschiedenen Peptidtransportsystemen und einer relativ großen Anzahl intrazellulärer Peptidasen besteht. Wie bei Lactococcus lactis im Detail gezeigt (1), wird Casein durch die Protease in unterschiedlich große Peptide zerlegt, die mit Hilfe der verschiedenen Peptidtransporter in die Zelle aufgenommen und dort durch die diverse Peptidasen bis zu den Aminosäuren abgebaut werden. Letztere stehen dann für die Proteinbiosynthese bzw. für weiteren Abbau zur Verfügung. Die Proteasen verschiedener MSB unterscheiden sich darin, an welchen Stellen sie die Caseine spalten. Damit unterscheiden sich die MSB in ihren Fähigkeiten, bioaktive Peptide freizusetzen. Bisher ist der Stamm Lactobacillus helveticus CM4 als besonders aktiv in der Freisetzung bioaktiver Peptide beschrieben worden (2). Die Wirksamkeit der während der Fermentation von Milch mit L. helveticus CM4 freigesetzten Peptide konnte in Versuchen mit Probanden nachgewiesen werden (3). Für MSB sind in den vergangenen Jahren intensiv molekularbiologische Methoden zur Analyse der Physiologie aber auch zur gentechnischen Veränderung dieser Organismen entwickelt worden (4), darunter auch eine Methode zum gezielten Gen „knock out“ (5). Im Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie wird seit vielen Jahren über die Biotechnologie von MSB gearbeitet (6-15). Es besteht Expertise bezüglich der proteo- und peptidolytischen Eigenschaften von MSB und anderen milchwirtschaftlich relevanten Mikroorganismen (6, 7) sowie in den wissenschaftlichen und rechtlichen Aspekten der Anwendung gentechnischer Mikroorganismen (8). Durch Isolierung und Charakterisierung nativer Plasmide aus MSB (9, 10) stehen uns „food grade“ Systeme zur Verfügung, die gentechnische Veränderungen nach dem Prinzip der „Selbstklonierung“ gestatten (11, 12). Entsprechend veränderte MSB, aber auch solche mit chemisch erzeugten Mutationen, wurden bereits in verschiedenen Fermentationen verwendet (12, 13, 14). Die beschriebene Methode zum Gen „knock out“ wurde erfolgreich zur Inaktivierung chromosomaler Gene eingesetzt (15). Es sollte ein systematisches Screening auf Milchsäurebakterien (MSB) durchgeführt werden, die möglichst aktiv in der Freisetzung bioaktiver Peptide sind. Mit dem aus dem Screening hervorgegangenen Stämmen sollten zwei Wege zur Herstellung bioaktive Peptide enthaltender Milchprodukte verfolgt werden, 1. direkte Fermentation und 2. Einsatz isolierter bakterieller Enzyme mit nachfolgender Anreicherung bioaktiver Peptide. Folgende Ziele wurden formuliert: • Isolierung und Charakterisierung proteolytisch aktiver Starterbakterien oder Probiotika, die bioaktive Peptide freisetzen • Fermentation von Milch durch geeignete Mikroorganismen und Bestimmung der Kinetik des Auftretens bioaktiver Peptide im fermentierten Produkt • Untersuchung der Auswirkung verschiedener eptidtransportmutationen der Mikroorganismen auf den Gehalt bioaktiver Peptide nach der Fermentation • Bereitstellung optimierter, fermentierter Milchprodukte für TP HealthGenEx • Klonierung und Charakterisierung der Protease-Gene bioaktive Peptide produzierender Mikroorganismen • Überproduktion geeigneter Enzyme mittels gentechnisch veränderter GRAS-Mikroorganismen(weiße Biotechnologie) • Reinigung und Bereitstellung der Enzyme für TP LactoPep • Analyse der Kinetik der Peptidfreisetzung durch mikrobielle Enzympräparate • Prüfung der bifidogenen in vitro-Aktivität angereicherter Galakto- und Milcholigosaccharid- Fraktionen aus TP LactoCarb. Im Vorhaben konnten proteolytisch aktive Milchsäurebakterien isoliert und hinsichtlich ihrer proteolytischen Eigenschaften charakterisiert werden. Die Bildung bioaktiver Peptide während der Fermentation wurde nachgewiesen. Die Gene zweier Stämme (L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis), die für auf der Zelloberfläche gebundene Proteasen kodierten, wurden kloniert und sequenziert. Mit löslichen Derivaten der Protease des L. delbrueckii subsp. bulgaricus 92059, die durch molekularbiologische Mutagenese erhalten wurden, konnten reproduzierbar Peptidgemische erhalten werden, die ebenfalls ACE-inhibitorische und anti-inflammatorische Aktivität aufwiesen. 32 Peptide wurden durch Massenspektrometrie in ihrer Molekülstruktur aufgeklärt. Damit stehen Fermentations- und enzymatische Verfahren zur Verfügung, mit denen sich bioaktive Peptidgemische aus Casein erzeugen lassen.

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