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Species selectivity of exogenous and endogenous aryl hydrocarbon receptor ligands

Project

Food and consumer protection

This project contributes to the research aim 'Food and consumer protection'. Which funding institutions are active for this aim? What are the sub-aims? Take a look:
Food and consumer protection


Project code: BfR-CPS-08-1322-697
Contract period: 01.08.2018 - 31.12.2018
Purpose of research: Experimental development

Der Arylhydrokarbonrezeptor (AHR) ist ein ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor, der eine bedeutende Rolle in der molekularen Toxikologie spielt. Bei Bindung von exogenen Schadstoffen wie Dioxinen, polyzykliklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK)oder polychlorierten Biphenylen (PCBs) an den AHR dissoziiert dieser vom den zytosolischen Chaperonkomplex , transloziert in den Zellkern, wo er an seinen heteromeren Partner ARNT (AHR nuclear translocator) bindet. Dieses Heterodimer bindet dann wiederum an spezifische DNA-Sequenzen (xenobiotic response elements, XREs) in den Promotoren der AHR Zielgene, um deren Transkription zu initiieren bzw. zu verstärken. Zu diesen gehören unter anderem Gene des Fremdstoffmetabolismus wie z.B. CYP1A1 und CYP1B1, die z.T. auch für eine Autoregulation des Systems sorgen. So führen Liganden die gleichzeitig Substrate des AHR-Regulons sind nur zu einer transienten Aktivierung des AHR, ganz im Gegensatz zu beispielsweise PCBs und Dioxinen, die keine CYP-Substrate sind und den AHR permanent aktivieren. Der AHR gehört zur Proteinfamilie der basic region helix-loop-helix-PER/ARNT/SIM (bHLH-PAS) Proteine. Er besitzt eine aminoterminale DNA-Bindungsdomäne, eine Ligandenbindungsdomäne (LBD), die auch eine Rolle bei verschiedenen Protein-Protein-Interaktionen spielt, sowie eine carboxyterminale Q-reiche Transaktivierungsdomäne. Neben einer sehr ausgeprägten Ligandenspezifität zeigt der AHR auch eine starke Speziesspezifität. So sind seit Jahrzehnten dramatische Unterschiede bei der AHR-vermittelten Toxizität von TCDD bekannt. Hier ist z. B. das Meerschweinchen 5000mal sensitiver als der Hamster, Maus und Ratte liegen dazwischen. Das mag zum Einen an der verschiedenen Verteilung von XREs im Genom liegen, zum Anderen liegt es aber auch an Sequenzunterschieden im AHR selbst. Besonders hervorzuheben ist hierbei der Austausch eines Valins zu Alanin in der LBD, der zu einer geringeren Affinität des humanen Rezeptors gegenüber Dioxinen und PAHs, verglichen mit dem murinen AHR, führt (zusammengefasst in Denison et al., 2011). Mitursächlich dürfte hier sein, dass der AHR neben seiner Rolle im Fremdstoffmetabolismus auch wichtige physiologische und entwicklungsbiologische Funktionen übernimmt. So reguliert der AHR wichtige Funktionen im Energie- und Lipidmetabolismus, im Zellzyklus und bei bestimmten Immunfunktionen. Vor allem in Organen mit Barrierefunktion (z. B. Haut, Lunge und Darm) ist diese Doppelfunktion des AHR von besonderer Wichtigkeit (Esser und Rannug, 2015). Hier spielen auch Liganden eine Rolle, die entweder endogen oder vom Mikrobiom synthetisiert werden. Besonders Metabolite des Tryptophan- und des Indolmetabolismus sind bekannte, schnell metabolisierbare AHR Liganden. Der Farbstoff Indirubin ist einer der potentesten AHR-Liganden, der sogar eine geringere EC50 als TCDD aufweist. Zumindest gilt dies für den humanen AHR (hAHR), wohingegen die Substanz am murinen AHR (mAHR) mehr als 100fach schwächer wirkt (Flaveny et al. 2009). Auch für Indoxylsulfat und Kynurenin wurde eine Speziesselektivität am hAHR beschrieben. Die molekularen Ursachen dafür sind bislang nicht bekannt. Lediglich der Valin zu Alanin Austausch konnte kürzlich ausgeschlossen werden, da die Mutation dieser Aminosäure nicht zu einer veränderten Affinität des hAHR für Indirubin, Indol und Indoxylsulfat führt (Hubbard et al., 2016). Indirubin selbst konnte auch in humanem Serum und Urin nachgewiesen werden (Adachi et al., 2001). Die starke Speziesspezifität des AHR hat direkte Auswirkungen auf speziesspezifische Toxizität. Ein besseres Verständnis und eine bessere Einschätzung dieser Effekte sind daher wichtig für die Hazard- und Risikobewertung von Stoffen. In diesem Projekt soll nun anhand von Indirubin als Modellmetaboliten ermittelt werden, welche molekularen Determinanten für Speziesselektivität endogener/exogener Liganden verantwortlich sind. Das Projekt ergänzt damit die bereits am BfR laufenden Studien zum AHR.

The aryl hydrocarbon receptor is a key regulatory molecule for xenobiotic phase I metabolism. Notably, there are strong species differences with regard to its affinity towards anthropogenic contaminants such as TCDD, PCBs and PAHs. For most of these xenobiotic substances the murine orthologue is more responive than the human variant. Contrastingly the hAHR shows a higher responsivenss for endogenous ligands such as indirubin or indole. The aim of this project was to test if these species differences can be attributed to specific amino acids. Thus various hybrid AHR constructs were constructed. In hybrid 1 the entire human ligand binding domain (LBD) was replaced with its murine counterpart while in hybrids 2 and 3 only the amino- or carboxy-terminal part of the LBD was exchanged, respectively. All constructs were subsequently transfected into ΔAHR-MCF7 cells and tested for CYP1A1- responsiveness following stimulation with TCDD or indirubin. Although qRT-PCR showed indirubin mediated AHR activation to be stronger for the human orthologue, results turned out to be less clear for the hybrids. When tested with indirubin all hybrids showed a strong response which clearly exceeded that observed for mAHR. However, with variants 2 and 3 both strongly outperforming even hAHR it became clear that the LBD can not be the sole determinant for species specifc ligand affinity.

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Subjects

Framework programme

BMEL Frameworkprogramme 2008

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