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Rolle nukleärer Interaktionen von paramyxoviralen Matrix Proteinen: Zelluläres ANP32B in Wirtszellmanipulation und Virusreplikation
Projekt
Förderkennzeichen: FLI-IMVZ-08-Ri-0442, 280662076
Laufzeit: 01.12.2015
- 30.11.2018
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Stichworte: Virus-Wirtszell-Wechselwirkungen
Kürzlich haben wir das Acidic leucin-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B (ANB32B) als nukleäre Zielstruktur für Hendra- und Nipahvirus Matrixprotein (M) identifiziert. Zusätzlich zeigen vorläufige Daten, dass auch ein anderer Vertreter der Paramyxovirusfamilie in der Lage ist über M mit ANP32B zu interagieren. Wir schließen daraus, dass die Bindung von ANP32B Teil eines konservierten Mechanismus ist, zumindest innerhalb der Unterfamilie Paramyxovirinae. Die Identifizierung der detaillierten Funktion dieser Interaktion in Virusreplikation und Wirtszellmanipulation kann zur Identifizierung von bisher unbekannten Mechanismen der Replikation und Pathogenese führen. Um die Rolle der ANP32B Bindung aufzuklären, erforschen wir hier (i) welche viralen M Proteine mit der nukleären Zielstruktur interagieren, (ii) welche Sequenzen in den M Proteinen für die spezifische Interaktion benötigt werden, (iii) wie ANP32B die Virusreplikation beeinflusst und (iv) ob zelluläre Funktionen von ANP32B im nicht-konventionellen Kernexport, in der Genregulation und in der Apoptoseinhibition durch die Interaktion mit M Proteinen moduliert werden. Wirtszellmanipulatorische Aktivitäten können eine substanzielle Rolle bei der Virusreplikation im infizierten Wirt spielen und somit von großer Bedeutung für das Verständnis von Virulenz und Pathogenese von Viren sein. Im Projekt werden etablierte Methoden für die Proteininteraktion mit der Mutagenese von M Proteinen und der Generierung von rekombinanten, ANP32B nicht bindenden Virusmutanten kombiniert. Einflüsse auf ANP32B Funktionen werden mit Hilfe von spezifischen Assays für nukleären Export, Genregulation und Apoptose in Anwesenheit von Plasmid expremierten M Proteinen und in infizierten Zellen ermittelt. Die in vitro Identifizierung von spezifischen M / ANP32B abhängigen molekularen Mechanismen und die Entwicklung von bindungsdefekten Virusmutanten bietet eine hervorragende Möglichkeit, die Rolle von ANP32B in Kontext von Krankheitsentwicklung und Immunmodulation zu untersuchen. Während das Arbeitsprogramm für die hier beantragten drei Jahre auf die in vitro Charakterisierung der molekularen Mechanismen fokussiert ist, werden in weiterführenden Arbeiten entwickelte Virusmutanten und die Kenntnisse über betroffene Mechanismen genutzt, um die Rolle des zellulären Interakteurs für die in vivo Replikation und Pathogenese von Henipa- und anderen Paramyxoviren zu untersuchen. Das Projekt ist auf eine Virus-Wirt Schnittstelle fokussiert, die substantiell zur Replikation und Wirtsmanipulation beitragen könnte. Deshalb wird die vorgeschlagene Arbeit nicht nur zum besseren molekularen Verständnis der Virusreplikation beitragen sondern führt möglicherweise zu neuen molekularen Zielstrukturen für die Inhibition von Virusreplikation und Krankheitsentwicklung.
In vergleichenden Interaktionsstudien konnten wir zeigen, dass die Interaktion von ANP32B mit viralen Matrixproteinen innerhalb der Familie der Paramxoviridae konserviert ist, während keine Hinweise für eine derartige Interaktion mit Pneumovirus order Rhabdovirus M Proteinen erzielt werden konnten (Günther et al., submitted to JGV). Darüber hinaus wurde mit den Arbeiten gezeigt, dass die ANP32B abhängige nukleäre Hendra Virus (HeV) M Akkumulierung vom nukleären Kernimport des ANP32B abhängt. Weiterhin zeigte die spezifische Kopräzipitation von M-ANP32B (keine Reinigung von M-ANP32A Komplexen), dass die Interaktion hoch spezifische ist und das alleinige Vorliegen eines stark negativ geladenen C-terminale Region oder einer Leucin-reichen N-terminalen Region, die beide in allen ANP32 Proteinen vorliegen, nicht für die Interaktion ausreicht. Konkret ist der hier erfolgte Nachweis einer intrazellulären Interaktion von ANP32B mit M aus Newcastle disease virus (NDV, Genus Avulavirus) und Sendai virus (SeV, Genus Respirovirus) von besonderer Bedeutung, da damit erstmals im Vergleich zu Henipaviren Paramyxoviren geringere Sicherheitsstufe zur Verfügung, die in nachfolgenden Projekten für systematische Pathogenesestudien verwendet werden können, zum Beispiel in ANP32B knock out Mäusen. Dabei bietet SeV als natürliches Mauspathogen ein enormes Potential um die postulierte Rolle von ANP32B in der viralen Pathogenese zu untersuchen. Umfangreiche Ala-Scan Mutagenesen über das gesamt HeV M Protein und deren Analyse führte zu einem umfassenden Überblick über die Bedeutung einzelner Aminosäurebereiche für die ANP32B abhängige Kernakkumulierung des M Proteins (Manuskript in Vorbereitung). Trotz Identifizierung von 10 intrazellulär nicht mehr interagierenden Mutanten zeigt die Gesamtheit der Daten, dass eher die positive Nettoladung der Proteinoberfläche für hoch spezifische Interaktion mit ANP32B verantwortlich ist statt einzelner Aminosäurepositionen. Während dies vermutlich die Generierung von rekombinanten, nicht bindenden Virusmutanten unmöglich macht, sind die hier gewonnenen Erkenntnisse insbesondere im Hinblick auf das breite Vorkommen dieser Virus-Wirt Interaktion und deren potentieller Bedeutung ein wichtiger Beitrag für die weitere wissenschaftliche Bearbeitung von Virus-Wirt Interaktionen in der Virusreplikation und Pathogenese.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Tiergesundheit
- Biotechnologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
FLI - Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (FLI - IMVZ)
