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Bestimmung von Virulenzdeterminanten von hoch pathogenen Nicht-H5/Nicht-H7 aviären Influenzaviren

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: FLI-IMVZ-08-Ri-0456, 279378352
Laufzeit: 01.07.2016 - 30.06.2019
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Aviäre Influenzaviren (AIV) des Geflügels werden in 16 Hämagglutinin (HA)-Subtypen eingeteilt, welche aufgrund ihrer Pathogenität in gering pathogen (LP) oder hoch pathogen (HP) klassifiziert werden. Während die hochpathogene aviäre Influenza (Geflügelpest) bislang lediglich durch Viren der Subtypen H5 und H7 verursacht wurden, die eine polybasische Spaltstelle (cleavage site, CS) im HA besitzen, gibt es interessanterweise vier Nicht-H5/H7-Stämme, die per Definition ebenfalls als HP einzuordnen sind. Diese umfassen ein H4N2-Isolat aus einer Wachtel in den USA und drei Viren vom Subtyp H10 von Vögeln aus Europa. Kenntnisse zu Virulenzdeterminanten dieser Viren sind bislang nicht bekannt und können mittels in unserem Institut etablierten reversen genetischen System untersucht werden. Das H4N2 Virus besitzt eine polybasische CS im HA, zeigt aber lediglich geringe Virulenz in Hühnern und repliziert in Zellkultur nicht ohne Zusatz von exogenem Trypsin. Das Potential des H4N2 Virus einen HP Phänotyp zu erwerben soll wie folgt untersucht werden (1) nach seriellen Passagen in embryonierten Hühnereiern oder Hühnern, (2) nach Erhöhung der Zahl an basischen Aminosäuren an der CS des HA, und (3) mittels Reassortment mit H5/H7 HPAIV. Im Gegensatz dazu tragen die H10 HPAIV ein monobasisches CS-Motiv und zeigen nach intranasaler bzw. intravenöser Infektion unterschiedliche Virulenzphänotypen. Mögliche zu untersuchende Ursachen für dieses Phänomen könnten in der Immunreaktion des Wirtes, einer unterschiedlichen proteolytischen Aktivierung des HA oder der unterschiedlichen Temperatur des Respirationstraktes gegenüber der Körperinnentemperatur begründet sein. Darüber hinaus ist bekannt, dass H10 AIV die Donoren des Neuraminidasegens für die - für den Menschen tödlichen - Influenzaviren der Subtypen H7N7 in 2003 in den Niederlanden sowie H7N9 in 2013-2014 in China waren. Die genetische Kompatibilität und das Vorkommen von Reassortanten von H10 AIV und humanen Viren, sowie eine effiziente Replikation in Säugetieren weisen auf ein pandemisches Potential dieser Viren hin, weshalb Kenntnisse zur Virulenz, Pathogenese, Adaptation und Behandlung gewonnen werden sollen. Zudem sind innerhalb der AIV Subtypen H10 und H7 Viren genetisch eng verwandt und werden beide von Vögeln in Europa isoliert. Daher soll auch die Möglichkeit von Reassortierungen mit H7 HPAIV untersucht werden. Zusammenfassend ist das kürzlich isolierte, gering virulente H4N2 Isolat das erste bekannte, natürlich vorkommende Nicht-H5/H7-Virus mit polybasischem CS-Motiv im HA. Demgegenüber zeigen manche H10 Viren mit monobasischem CS-Motiv hohe Virulenz im Geflügel und besitzen pandemisches Potential. Die molekulargenetischen Untersuchungen dieser Viren sollen interessante, grundlegende Aspekte zur Virulenz von Influenzaviren eröffnen und zur Milderung der Gefährdung der Gesundheit von Mensch und Tier beitragen.

Adaptive Mutationen im Robben-H10N7-Virus: (Dittrich et al. 2017). In der ersten Phase dieses Projekts wurde der Einfluss von 8 einzigartigen Mutationen im HA1-Protein von Robbe H10N7 in vitro untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Seal-H10N7-Virus eine doppelte Rezeptorbindungsaffinität zu Sialinsäurerezeptoren von Vögeln und Säugern zeigte. Die Affinität zu Rezeptoren der Säugetiere wurde durch Q220L im Rand der rezeptorbindende Domäne verliehen, was die Affinität eines Vogel-H10N4-Virus zu Rezeptoren vom Säugetiertyp erhöhte und die Affinität zu Rezeptoren vom Vogel-Typ vollständig aufhob. Erstens zeigen diese Ergebnisse, dass H10N7 adaptive Mutationen in der HA1-Untereinheit erwarb, um die Replikation in Säugetierzellen zu verbessern und die Replikationseffizienz im ursprünglichen Vogelwirt beizubehalten. Zweitens waren Mutationen an derselben Position für die Anpassung der H2N2- und H3N2-Subtypen von Vögeln beim Menschen und des H3N8-Virus von Pferden bei Hunden wesentlich, was die mögliche zoonotische Rolle von Robben als Mischgefäß oder die Anpassung von AIV von Vögeln an andere Säugetiere unterstreicht. Entwicklung des nicht pathogenen (HP) Aviären Influenzavirus (AIV) ohne H5 / H7 (Gischke et al. 2020). In der ersten Phase dieses Projekts untersuchten wir mithilfe von Reverse-genetischen Techniken und Tierversuchen die Entwicklung von HPAIV aus einem einzigartigen H4N2 mit einer natürlichen polybasischen HA-Spaltstelle (CS), die den klassischen HPAIV-H5 / H7-Viren ähnelt. Die Entfernung einer hochkonservierten Glykosylierungsstelle neben dem HACS erhöhte die Virusausbreitung in verschiedenen Organen von Hühnerembryonen, hatte jedoch keinen Einfluss auf die geringe Virulenz von H4N2 bei Hühnern. Eine erhöhte Anzahl basischer Aminosäuren im HACS beeinflusste die Virusübertragung und -ausscheidung bei Hühnern negativ. Diese Ergebnisse können erklären, warum Nicht-H5 / H7 mit polybasischem HACS in der Natur nicht häufig sind. Eine Neuzuordnung mit HPAIV H5N1, jedoch nicht mit HPAIV H7N7, erhöhte die Virulenz des H4N2-Virus. Dies weist darauf hin, dass die Entwicklung von HPAIV H4N2 eine spezifische Konstellation von Gensegmenten erfordert, die denen von H5N1 ähnlich sind, was möglicherweise auch erklärt, warum HPAIV H4N2 bisher nicht isoliert wurde. Dittrich A, Scheibner D, Salaheldin AH, Veits J, Gischke M, Mettenleiter TC, Abdelwhab EM. Impact of Mutations in the Hemagglutinin of H10N7 Viruses Isolated from Seals on Virus Replication in Avian and Human Cells. Viruses 2018; 10. doi pii: E83. doi: 10.3390/v10020083. Gischke M, Ulrich R, Fatola O I, Scheibner D, Salaheldin A H, Crossley B, Böttcher-Friebertshäuser E, Veits J, Mettenleiter TC, Abdelwhab EM. Insertion of basic amino acids in the hemagglutinin cleavage site of H4N2 avian influenza virus (AIV) reduced virus fitness in chickens which is restored by reassortment with highly pathogenic H5N1 AIV. International Journal of Molecular Science 2020. doi: 10.20944/preprints202002.0391.v1

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