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Klassifizierung von Nanomaterialien nach oxidativem Stresspotential auf Ebene von oxidativen Proteinmodifikationen
Projekt
Förderkennzeichen: BfR-CPS-08-1336-102
Laufzeit: 01.04.2012
- 30.09.2014
Forschungszweck: Bestandsaufnahme & Abschätzung
Zurzeit existiert noch kein grundlegendes, systematisches Verständnis darüber, wie die physikochemischen Eigenschaften von NM die Verteilung im Organismus, die Aufnahme in die Zelle sowie die Toxizität beeinflussen. Gruppierungsansätze sind für NM noch weitgehend unbekannt, so dass jede NM Variante einer neuen Testung und Bewertung unterzogen werden muss. Selbst wenn sich NM hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sehr ähnlich sind, können die toxikologischen Daten zu einem NM nicht ohne weiteres auf ein Anderes übertragen werden. Jeder einzelne Parameter wie z.B. die chemische Zusammensetzung, Größe, Form, Kristallinität und Oberfläche hat Einfluss auf die Wirkung eines NM. Um mit der enorm großen Anzahl an NM Varianten umzugehen und insbesondere um die besonders kritischen NM zu identifizieren ("NM of concern"), ist es notwendig, verlässliche in vitro Screening-Verfahren zu entwickeln. Solche Screening-Verfahren erlauben es kritische NM für eine spätere umfänglichere Testung zu priorisieren. Häufig verursachen NM oxidativen Stress und führen zur Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Dies wurde sowohl in vitro als auch in vivo häufig nachgewiesen und gilt aktuell als eines der wichtigsten Paradigmen bei der Erklärung der NM Toxizität. Diese Radikale können zelluläre Bestandteile oxidieren und führen u.a. zu oxidativen Proteinmodifikationen wie beispielsweise Proteincarbonylen. Die Bildung von Proteincarbonylen ist ein irreversibler Schritt, der die Proteine meist auch inaktiviert bzw. ihre Funktionalität einschränkt. Proteincarbonyle entstehen dabei nicht willkürlich oder zufällig an beliebigen (z.B. häufig vorkommenden) intrazellulären Proteinen. Vielmehr sind gezielt bestimmte Proteine betroffen, die dafür besonders anfällig sind. Dieser Vorgang ist also selektiv. Demnach könnte die Untersuchung und Identifizierung von solchen modifizierten Proteinen wichtige Hinweise auf den Wirkungsmechanismus von verschiedenen NM geben. Darüber hinaus eignet sich ein solcher Ansatz auch zur Klassifizierung von NM hinsichtlich ihres oxidativen Stresspotentials. Der Nachweis von Proteincarbonylen könnte somit die Basis eines aussagekräftigen Screening-Assays sein. Auf Grund der hohen Bedeutung des oxidativen Stresspotentials bei der Erklärung der NM- Toxizität soll hier untersucht werden, ob sich im Umkehrschluss über die Untersuchung des oxidativen Stresspotentials eine Vorhersage über eine mögliche Toxizität machen lässt und ob sich dies als Screening-Prinzip nutzen lässt. Zielstellung dieses Projektes ist es daher, ein Screening-Verfahren für NM auf Basis des Nachweises von Proteincarbonylen zu entwickeln.
Nanomaterialien (NM) werden in zahlreichen, unterschiedlichen Produkten eingesetzt. Die meisten bisher verwendeten NM basieren auf wenigen Grundmaterialien, welche jedoch durch Variationen in der Größe, der Form oder durch Oberflächenmodifikationen in vielen verschiedenen Varianten synthetisiert werden können. Zurzeit existiert noch kein grundlegendes Verständnis darüber, wie die physikochemischen Parameter, die Verteilung im Organismus, die Aufnahme in Zellen oder die Toxizität beeinflussen. Jede NM Variante muss einer neuen Testung und Bewertung unterzogen werden. Es fehlen zuverlässige in vitro Screening- Verfahren, welche es ermöglichen, diejenigen NM zu identifizieren, bei denen Anlass zur Besorgnis hinsichtlich einer möglichen toxischen Wirkung besteht (so genannte „nanomaterials of concern“). Zielstellung dieses Projektes war es, ein in vitro Screening-Verfahren zu entwickeln, welches auf dem oxidativen Stresspotential der NM basieren sollte. Die für dieses Projekt gesetzten Ziele wurden alle in vollem Umfang erreicht. Oxidativer Stress gilt als ein Hauptparadigma zur Erklärung der NM Toxizität in vitro und in vivo. Hier diente die oxidative Modifikation von Proteinen, im speziellen der Nachweis von Proteincarbonylen, als Nachweismethode von oxidativen Stress. In der ersten Förderperiode wurden insgesamt drei geeignete Zellmodelle identifiziert: humane THP-1 Makrophagen, humane A549 Lungenepithelzellen und NRK-52E Nierenepithelzellen der Ratte. Mit diesen wurden in der zweiten Förderperiode 10 verschiedene, sehr gut charakterisierte NM aus dem JRC NM Repositorium untersucht. Eingesetzt wurden drei verschiedene mehrschichtige Kohlenstoffnanoröhren (MWCNT), zwei verschiedene ZnO, zwei TiO2, zwei SiO2 sowie ein Silber NM. Eine deutliche Zytotoxizität in allen drei Zellsystemen zeigten nur die beiden ZnO NM. Eine geringfügige Zytotoxizität zeigten auch das Nanosilber und eines der beiden SiO2 NM (NM-203) wobei dies vom Zellmodell abhing. Die MWCNT zeigten nur in den THP-1 Makrophagen toxische Effekte, welche abhängig von der Länge der MWCNT waren. Am stärksten toxisch waren die längsten MWCNT NM-401. Von den zehn untersuchten NM waren fünf positiv hinsichtlich der Bildung von Proteincarbonylen. Es zeigte sich eine sehr gute Korrelation zur beobachteten Zytotoxizität. Die genauen Auswirkungen aller hinsichtlich der Carbonylbildung positiven NM wurden im 2D Gelsystem umfassend charakterisiert. Alle modifizierten Proteine wurden massenspektrometrisch identifiziert. Jedes NM zeigte ein individuelles Pattern an modifizierten Proteinen. Alle NM führten zur Carbonylierung von Zytoskelettproteinen oder Hitzeschockproteinen. Bei den besonders toxischen NM fanden sich auch Modifikationen in wichtigen zellulären Enzymen, wie z.B. Enzymen aus der Glykolyse, dem Zitratzyklus oder der ATP Synthese. Carbonylierung führt häufig zu einem Funktionsverlust der Proteine. Daher sind durch deren Analyse interessante Einblicke in die Toxizitätsmechanismen möglich. Dieses Projekt zeigt, dass die Proteincarbonylierung als Basis für ein Screening- Verfahren sehr gut geeignet ist. Andere Verfahren zum Nachweis von oxidativem Stress basieren meist auf chemischen Sonden (z.B. zum direkten Nachweis von Sauerstoffradikalen) und sind daher häufig störanfällig für Interferenzen durch die NM. Der Nachweis von Proteincarbonylen hingegen ist nicht durch derartige Interferenzen störbar. Das Nachweisverfahren ist einfach und sensitiv. Darüber hinaus korrelieren die Ergebnisse des Carbonylnachweises sehr gut mit der Toxizität der NM.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Biotechnologie
- Toxikologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
BfR - Abteilung 7: Chemikalien- und Produktsicherheit (BfR - CPS)
