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Einfluss der Funktionalisierung von Nanosilber auf die analytische Erfassbarkeit der Partikelgröße in einem komplexen proteinhaltigen Medium (Nano 37)

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-LBV-08-1032 Nano 37
Laufzeit: 01.01.2018 - 30.06.2020
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Im Rahmen eines EU-Projektes wurde eine Analytik zur Erfassung von technisch herge-stellten Nanomaterialien (ENM = engineered nanomaterial) in Lebensmitteln mittels Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4) und kombinierter Detektoren erarbeitet und von Löschner et al. für eine spezifische ENM-Lebensmittel¬kombinationen in-house validiert (Food Chemistry 181 (2015) 78–84). Dabei handelte es sich um eine Methode zur Isolie-rung von ENMs aus einer komplexen proteinhaltigen Lebensmittelmatrix (Hähnchenfleisch) sowie der folgenden analytischen Erfassung der Nanopartikel. In diesem Projekt nun soll untersucht werden, ob sich die publizierte Methode für materi-algleiche und größenähnliche Nanomaterialien anwenden lässt, wenn diese eine andere Oberflächenfunktionalisierung aufweisen, als die ENMs, für die die Methode ursprünglich entwickelt wurde. Hierzu sollen drei verschieden funktionalisierte Nanosilber-Materialien vergleichbarer Größe sowie ein kommerziell verwendetes Produkt eingesetzt werden. Zusätzlich sollen die Veränderungen der Nanomaterialien exemplarisch während der Aufarbeitung und Analytik mittels elektronenmikroskopischer Aufnahmen dokumentiert werden.

Ziel aller Methoden zur Messung von Nanopartikeln in Lebensmitteln ist es, diese nach erfolgter Isolation aus der Matrix möglichst quantitativ und in der ursprünglichen Partikelgröße analytisch zu erfassen. Zur Erarbeitung solcher Methoden werden zunächst Lebensmittel mit ENMs bekannter Größe gespikt. Eine solche Methode, die im Rahmen eines EU-Projektes (Löschner et al.2013) erarbeitet wurde, beinhaltet die Isolation von mit Polyvinyl¬pyrrolidone funktionalisierten Nanosilber-Partikeln aus einer Modell-Lebensmittel¬matrix (Hähnchen¬fleisch) und anschließender AF4-Analytik. Im Rahmen dieser Studie wurde die Über¬trag¬barkeit der Methode auf anders funktionalisierte Nanosilberpräparate geprüft. Zu diesem Zweck wurden drei verschiedene Nanosilber-Präparate (Durchmesser 60 nm; Coating: Polyvinylpyrrolidone, Liponsäure, Poly¬ethylen¬glycol) sowie ein kommerziell verwen¬detes Produkt (stabilisiert mit Polyoxyethylene Glycerol Trioleate und Tween 20) ausgewählt und im Hinblick auf Partikelgrößenverteilung (dynamische Lichtstreuung), Ober¬flächen¬ladung (elektrophoretische Lichtstreuung) und Morphologie (Rasterelektronenmikroskopie) charakterisiert. Für die Partikelanalytik sowie die Untersuchung der physikalischen Stabilität mittels UV-Vis-Spektrometrie wurden als Dispergierlösungen Wasser sowie die für den enzymatischen Aufschluss verwendete Elektrolytlösung eingesetzt. Schon bei der Charakterisierung des Materials in diesen Lösungen ohne Lebensmittelmatrix zeigten sich große Unterschiede im Hinblick auf die Stabi¬lität, was sich in den gemessenen Partikelgrößen, Oberflächen¬ladungen sowie der Plasmonen¬reso¬nanz zeigte. Entsprechend wiesen diese unbehandelten verschieden funktionalisierten Nanosilber gleicher Partikelgröße auch in der AF4 unterschiedliche Retentionszeiten und Wiederfindungsraten auf, was auf coating-spezifische Wechsel¬wirkungen zwischen Partikeln und der AF4-Membran schließen lässt. In einem weiteren Schritt wurde das Lebensmittel (homogenisiertes Hähnchenfleisch) nach Vorschrift (Löschner 2013) mit den Nanosilberproben gespikt. Nach Inkubation wurden die Nanopartikel mit einer enzymatischen Aufschlussmethode durch Degradation des Hähnchenfleisches aus der Lebensmittelmatrix isoliert. Die Bestandteile der aufgeschlossenen Proben (Nano¬silber¬partikel, Matrixreste, Silber-Proteinkomplexe) wurden durch Feldflussfraktionierung getrennt und mittels verschiedener Detektoren (UV-Vis, MALS, ICP-MS) erfasst und ausgewertet. Um die Wechselwirkung von Nanosilber mit den Enzymproteinen zu untersuchen (Nanosilber hat eine hohe Protein-Affinität), erfolgten parallel dazu als Blindversuche AF4-Analysen von Nanosilberproben, die ohne Fleischmatrix in der Enzymlösung inkubiert wurden Es zeigte sich, dass Nanosilberpartikel überwiegend in Verbindung mit dem Protein der Enzymlösung eluierten. Abhängig vom Nanosilbercoating verschlechterte sich gleichzeitig schon in diesen Blindversuchen ohne Lebensmittelmatrix sowohl die Wiederfindung des Silbers während der Fraktionierung als auch die Fraktionierung selbst. Dies liegt sowohl an Wechselwirkungen zwischen den Partikeln und dem Material des Analysensystems als auch an Wechselwirkungen zwischen den Partikeln sowie zwischen Partikel und Proteinen, die zur Agglomeration des Nanosilbers führen. Beispielhaft wurde dies für ein Nanosilber gezeigt, für das REM-Analysen zu verschiedenen Zeiten der Fraktionierung durchgeführt wurden. Nach Inkubation der Nanosilberproben im Lebensmittel und nachfolgender Isolation wurden vergleichbare AF4-Fraktogramme wie nach Inkubation in Enzymlösung erhalten. Das heißt, das Silber lag größtenteils gebunden an die verschiedenen Abbauprodukte des enzymatischen Lebensmittelaufschlusses vor. Neben partikulärem Nanosilber, das an Proteinen bzw. Matrixabbauprodukten gebunden war und mittels Lichtstreuung (MALS) detektiert werden konnte, zeigten sich hier im Gegensatz zu den Blindversuchen (Inkubation des Silbers in Enzymlösung) jedoch auch Silber-Proteinkomplexe, die nur mittels ICP-MS detektiert werden konnten. Dies deutet darauf hin, dass während des Enzymaufschlusses Silber gelöst wird, welches an Protein gebunden wird. Das partielle Auflösen des Nanosilbers muss entsprechend zu einer morphologischen Veränderung der Silberpartikel und deren Partikelgrößenverteilung führen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass es nicht möglich war, die von Löschner et al. erarbeitete und in-house validierte Analysenmethode für Nanosilber mit einer spezifischen Funktionalisierung in einer bestimmten Lebensmittelmatrix mit akzeptablen Nanosilber-Wiederfindungsraten auf anders funktionalisierte Nanosilber gleicher bzw. ähnlicher Partikelgröße zu übertragen. Zudem wurde festgestellt, dass sich während der Inkubation des Silbers im Lebensmittel und/oder während der nachfolgenden Isolierung Silber gelöst hat, so dass nicht davon auszugehen ist, dass die Methode geeignet ist, Nanosilber verlustfrei und ohne Änderung der Partikelgröße aus der Matrix zu isolieren. Auch wenn für die einzelnen Nanosilberproben jeweils reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden konnten, erfüllt diese Methode nicht die Anforderungen an eine Routineanalytik, wie Übertragbarkeit auf verschiedene Matrizes und unbekannte Nanosilberpräparate bzw. Nanomaterialien ohne oder mit nur geringen Anpassungen sowie Stabilität und Unversehrtheit der Partikelpopulationen während der Probenvorbereitung.

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