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LC-MS/MS Methodenentwicklung zur Bestimmung von Ciguatoxinen in Fisch
Projekt
Förderkennzeichen: BfR-SiN-08-1322-705
Laufzeit: 01.07.2018
- 31.12.2019
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Ciguatera fish poisoning (CFP) ist eine Vergiftung des menschlichen Nervensystems, die nach dem Verzehr bestimmter tropischer Rifffische, welche Ciguatoxine (CTX) enthalten, auftritt [1]. Diese Toxine sind Metaboliten von Verbindungen, die von benthischen Dinoflagellaten der Gattung Gambierdiscus gebildet werden. Wenn Zellen von Gambierdiscus spp. durch pflanzenfressende Fische aufgenommen werden, werden die Vorläufer bioakkumuliert und in fettlösliche CTXs umgewandelt. In Fischen, welche sich von den pflanzenfressenden Fischen ernähren, werden diese CTXs weiter angereichert und metabolisiert. Nach dem Verzehr von Fisch, der CTX enthält, tritt ein Krankheitsbild mit vielzähligen möglichen gastrointestinalen, kardiovaskulären, neurologischen und neuropsychologischen Symptomen auf. CFP-Symptome können tage- bis monatelang andauern. Weltweit wird die Häufigkeit von CFP auf 10.000 – 50.000 Fälle jährlich geschätzt. Damit stellt sie die am häufigsten berichtete Vergiftung in Verbindung mit natürlichen marinen Toxinen dar. In der EU gibt es keine gesetzlichen Vorgaben bezüglich CTX Höchstgehalten oder offizielle Analysenmethoden. Allerdings gilt laut Verordnung (EG) Nr. 853/2004, dass Fischereierzeugnisse, die CTX enthalten, nicht in den Handel gelangen dürfen. In den USA etablierte die U.S. Food and Drug Administration (FDA) Richtwerte für den Gehalt an Karibischem (für C-CTXs; 0,1 ng/g C-CTX-1 Äquivalente) und Pazifischem (für P-CTXs; 0,01 ng/g P-CTX-1 Äquivalente) CTX. In Deutschland traten seit 2012 jährlich Ciguaterafälle auf, die durch den Verzehr von importierten Fischen ausgelöst wurden, welche u. a. aus Fanggebieten im Indischen Ozean stammten. Die CTX-Profile dieser Fische sind für diese Fanggebiete charakteristisch und unterscheiden sich von Karibischen und Pazifischen CTXs. Für das Indische CTX sind derzeit noch keine Standardsubstanzen verfügbar, sodass diese Toxine nicht eindeutig identifiziert und quantifiziert werden können. Das Vorkommen von Gambierdiscus spp. in Europa wurde erstmals 2003 von der Insel Kreta berichtet. Die CFP-Vergiftung von Fischern, die Fisch aus der Region um die Insel Madeira aßen sowie Vergiftungen aus den Kanaren, zeigen das Vorhandensein von CTX in Europäischen Gewässern [4]. Obwohl die meisten CFP-Fälle in Europa bisher auf importierten Fisch zurückzuführen waren, ist es notwendig darauf vorbereitet zu sein, dass Ciguatera aufgrund der möglichen Verbreitung von Gambierdiscus spp. in europäischen Gewässern ein steigendes Problem in der EU wird. Derzeit liegen die Bedingungen im Mittelmeer im Grenzbereich für das Wachstum von Gambierdiscus, jedoch wird eine Erwärmung der Gewässer vorhergesagt, sodass bessere Voraussetzungen zu erwarten sind [2]. Die Erfassung der Häufigkeit von CFP-Fällen und ciguatoxischen Fischen in Europa kann durch die Entwicklung verlässlicher Nachweismethoden, Diagnosemöglichkeiten, Probenahmestrategien und Fallberichtssysteme erreicht werden. Analysenmethoden für CTXs wurden etabliert, um im Rahmen von CFP-Ausbrüchen die klinische Diagnose durch den CTX-Nachweis in Verdachtsproben von Fischen zu untermauern. Derzeit wird meistens ein zweigeteiltes Verfahren angewandt, welches zunächst ein semi-quantitatives Screening auf Toxizität entsprechend des CTX-Wirkmechanismus mittels in-vitro Maus-Neuroblastom Zellassay (N2a) und dann die molekulare Bestätigung von CTXs mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) umfasst. CTXs aus verschiedenen Fanggewässern unterscheiden sich in ihrer chemischen Struktur. Es wurden spezifische CTX-Kongenere bestimmt, welche als regionale Biomarker dienen. Proben, die mittels N2a-Zellassay positiv getestet wurden, werden auf die Anwesenheit dieser CTX-Kongenere analysiert. Die FDA verwendet in Fisch aus dem Atlantik das Kongener C-CTX-1, während für Fisch aus dem Pazifik P-CTX-1 genutzt wird. Der Messmodus Multiple Reaction Monitoring im positiven Ionisationsmodus ist die MS/MS-Technik der Wahl zur Bestätigung der Anwesenheit der spezifischen CTX-Kongenere. Allerdings basieren die gemessenen Übergänge meist auf mehrfachem Verlust von Wasser. Die Fragmentierung ist infolgedessen wenig spezifisch und damit für eine eindeutige Bestätigung nur eingeschränkt geeignet, solange keine Standardsubstanzen für die jeweiligen CTX-Kongenere verfügbar sind. Die als regionale Biomarker identifizierten CTX-Kongenere sind nur schwer erhältlich. Begrenzte Mengen P-CTX-3 können käuflich erworben werden, während alle anderen derzeitig aus Fischgewebe isoliert werden müssen. Wenn entsprechende Standardsubstanzen fehlen, können Zytotoxizitätsprofile von den Essensresten oder rohem Fisch erstellt werden. Dazu werden flüssigchromatographische Fraktionen der Probenextrakte mittels N2a-Zellassay getestet [3]. Ziel des Projektes ist die Etablierung einer LC-MS/MS-Methode zum Nachweis von C-CTXs und P-CTXs in Fischen, gefolgt von der Optimierung der Nachweismethode von Indischem CTX und deren inhouse Validierung.
References
[1] Scheuer PJ, et al. 1967. Ciguatoxin: isolation and chemical nature. Science 155:1267-1268.
[2] Shaltout M, Omstedt A. 2014. Recent sea surface temperature trends and future scenarios for the Mediterranean Sea. Oceanologia 56:411-443
[3] Abraham A, et al. 2012. Caribbean ciguatoxin profile in raw and cooked fish implicated in ciguatera. Food Chemistry 131:192-198.
[4] Vlamis, A, Katikou, P. 2015. Human impact in Mediterranean coastal ecosystems and climate change: emerging toxins. Climate change and marine and freshwater toxins. 8: 237-269
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Verfahrenstechnik
- Toxikologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
BfR - Abteilung 8: Sicherheit in der Nahrungskette (BfR - SIN)
