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Entwicklung von vaskulären 3D Geweben und Etablierung von Langzeitkulturen zur Etablierung eines Multi-Organ Chip als Alternative zum Tierversuch für systemische Toxizitätsprüfungen mit wiederholter Substanzgabe

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-ZEBET-08-1322-601
Laufzeit: 01.03.2014 - 31.12.2014
Forschungszweck: Angewandte Forschung

In den letzten Jahren wurden für eine Reihe von toxikologischen Endpunkten Alternativmethoden entwickelt, die wissenschaftlich validiert und vom Gesetzgeber als Ersatzmethoden anerkannt wurden. Dabei handelt es sich um Methoden zur Bewertung topischer Expositionen (Ätzung oder Reizung der Haut und des Auges) und Methoden, die grundsätzliche Mechanismen spezifischer Toxizitäten (Phototoxizität, Genotoxizität) prüfen und dadurch bei negativen Ergebnissen helfen, eine toxische Wirkung auszuschließen.. Systemische Expositionen können jedoch über eine Vielzahl, ggf. organspezifischer, Mechanismen verschiedene adverse Effekte auslösen. Dabei spielen Wechselwirkungen zwischen Organsystemen z.B. durch Metabolisierung von Substanzen in der Leber oder Freisetzung sekundärer Faktoren durch primär betroffene Organe, aber auch Barriereaspekte eine wichtige Rolle. Daher ist es ungleich schwieriger systemische Toxizitätsprüfungen, insbesondere bei wiederholter Verabreichung, durch tierversuchsfreie Methoden zu ersetzen. Orale systemische Toxizitätsprüfungen nach OECD TG 407 (Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study) mit wiederholter Gabe werden meistens an Ratten durchge-führt, aber es werden gelegentlich auch Hunde oder nichtmenschliche Primaten eingesetzt. Hierzu wird den Versuchstieren die zu testende Substanz oral, über 28 Tage täglich verabreicht. Danach werden neben klinischen und histopathologischen Untersuchungen die Primäreffekte auf verschiedene Organe wie Leber, Niere, Lunge, ZNS, Reproduktionsorgane, das hämatopoietische System, das Immunsystem und das endokrine System untersucht, um unschädliche Konzentrationen bzw. „No Observed Adverse Effect Levels“ (NOAEL) abzuleiten. Die EU-Chemikalienrichtlinie „REACH“ sieht diese Testungen für Stoffe mit einem Produktionsvolumen über 10 Tonnen pro Jahr vor und der 28-Tage Test ist auch ein Standardtest bei der präklinischen Prüfung von Arzneimitteln. Zudem kann er seit dem in Kraft treten der letzten Stufe der 7. Änderung der Kosmetik-Richtlinie am 11.03.2013 nicht mehr für die toxikologische Bewertung von kosmetischen Inhaltsstoffen angewendet werden. Um die Zahl an Versuchstieren die für systemische, subakute oder chronische Toxizitätstestungen eingesetzt werden auf ein absolut notwendiges Maß zu begrenzen und die Sicherheit kosmetischer Inhaltstoffe weiterhin gewährleisten zu können, werden prädiktive tierversuchsfreie Testverfahren dringend benötigt. Eine vielversprechende Alternative bietet die 'Multi-Organ-Chip' (MOC) Technologie, bei der Organ-ähnliche Zellkulturen in Miniaturformat auf einem Chip so verbunden werden, dass sie funktionelle Organinteraktionen im Organismus tatsächlich nachstellen können. Gesamtziel des Projektes ist die Entwicklung von künstlichen Organsystemen, um die Prüfung von chemischen Stoffen wie z.B. im subakuten Toxizitätstest (28-Tage Test nach OECD TG 407) zu ergänzen und schlussendlich zu ersetzen. Das hier beantragte Vorhaben befasst sich dabei mit der Etab-lierung 3-dimensionaler, vaskulärer Strukturen, die zum einen als funktionelle Verbindungseinheiten zwischen den verschiedenen Organsystemen im MOC benötigt werden und zum anderen auch für die Etablierung eines Modells der Blut-Hirn-Schranke optimiert werden sollen. Im Rahmen dieser Arbeiten sollte geprüft werden, ob sie differenzierende embryonale Stammzellen eigenen, Aspekte der Vaskulogenese zu analysieren und Endothelzellen zu differenzieren, die für einen Einsatz in Mikrofluidiksystemen geeignet sind. Im Bearbeitungs-zeitraum konnten verschiedene Methoden zur Analyse der Differenzierung von Endothel-zellen aus embryonalen Stammzellen etabliert werden, einschließlich qRT-PCR für endothe-liale Marker, Immunhistochemische Analysen mit endothelspezifischen Antikörpern und die Kultivierung in einer Kollagenmatrix. Dabei konnte gezeigt werden, dass Endothelzellen, aber auch Zellen der glatten Muskulaur wie auch Perizyten in relativ kurzer Zeit in der Stammzellkultur entstehen und innerhalb von 2 Wochen komplexe dreidimensionale und blutgefäßähnliche Strukturen bilden.

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