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Struktur-Aktivitätsbeziehung von hepatotoxischen Pyrrolizidinalkaloiden

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-LMS-08-1322-591
Laufzeit: 01.03.2014 - 31.12.2016
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Die Gruppe der ungesättigten Pyrrolizidinalkaloide (PA) zählt zu den giftigsten bekannten Substanzen. Die PA umfassen mehr als 400 Alkaloide, die unter anderem im Gemeinen Greiskraut (Senecio vulgaris L.) vorkommen. Aus Vergiftungsfällen durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln ist bekannt, dass PA bei Mensch und Tier lebensbedrohliche Leberschäden verursachen können. Im Tierversuch wirken diese Alkaloide krebserregend und in verschiedenen in vitro- und in vivo-Tests genotoxisch. Die toxische Wirkung der PA entsteht durch die enzymatischen Umwandlungen durch die hauptsächlich in der Leber exprimierten Enzyme. Die Wirkmechanismen der PA sind noch nicht vollständig aufgeklärt. Erste Untersuchungen zu den molekularen Wirkmechanismen der PA im Sonderforschungsprojekt „Entwicklung eines hepatischen in vitro-Testsystems zur sensitiven Detektion von Pyrrolizidinalkaloiden“ (1322-454) zeigten deutliche Hinweise auf eine Struktur-Aktivitätsbeziehung der untersuchten PA Heliotrin, Echimidin, Senecionin und Senkirkin. Diese vier PA stehen repräsentativ für alle möglichen Strukturtypen der PA. Sie repräsentieren sowohl alle drei vorkommenden Necinsäurestrukturen (Monoester, Diester, zyklischer Diester) als auch die häufigsten drei Necinbasen (Retronecin-, Heliotridin-, Otonecintyp). Aufgrund dessen sind sie für die Untersuchung von Struktur-Aktivitätsbeziehungen bestens geeignet. Im Antragsjahr sollen die Struktur-Aktivitätsbeziehungen der PA auf drei Ebenen genauer analysiert werden. Zum einen soll der strukturabhängige Transport der PA über die gastrointestinale Barriere im Caco-2-Zellmodell untersucht werden. Die nicht-zyklischen PA Heliotrin und Echimidin zeigen im Gegensatz zu den zyklischen PA einen MDR1-abhängigen Transport. Diese Strukturbeziehung soll mit weiteren PA-Vertretern beider Strukturklassen überprüft werden. Im zweiten Teil sollen Struktur-Aktivitätsbeziehungen der PA auf Genexpressionsebene analysiert werden. Die Basis hierfür sollen die whole genome µ-Arraydaten bilden, die im Sonderforschungsprojekt 1322-454 generiert wurden. Im dritten Teil sollen Analysen auf Proteinebene folgen. Hierbei soll die Interaktion der PA mit verschiedenen Rezeptoren mit Hilfe von Reportergenassays untersucht werden. Ferner soll ein Teilziel die Entwicklung eines geeigneten in vitro-Leberzellmodells sein, dass für die Analyse der hepatozellulären Wirkmechanismen der PA notwendig ist. Die geplanten Untersuchungen sollen einen Beitrag zur Aufklärung der Wirkweise/Entfaltung der Toxizität der PA im Menschen beitragen und wichtige Hinweise zur oralen Bioverfügbarkeit der PA liefern. Ergebnisse: Zur Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehung der molekularen Wirkmechanismen von Pyrrolizidinalkaloiden (PA) wurden die vier PA Heliotrin, Echimidin, Senecionin und Senkirkin als Modell-PA ausgewählt. Sie repräsentieren sowohl alle drei vorkommenden Necinsäurestrukturen (Monoester, Diester, zyklischer Diester) als auch die häufigsten drei Necinbasen (Retronecin-, Heliotridin-, Otonecintyp). Im Antragsjahr wurde der strukturabhängige Transport der PA über die gastrointestinale Barriere im Caco-2-Zellmodell untersucht. Die Hypothese, dass der Transport der PA über das Epithel strukturabhängig ist und Mono- sowie offenkettige Diester durch einen aktiven Efflux zurück in das Darmlumen transportiert werden, konnte nur teilweise bestätigt werden. Für die Monoester Intermedin und Lycopsamin und den Diester Echimidin konnte ein apikaler Efflux über ABCB1 nachgewiesen werden, wohingegen für den Diester Lasiocarpin und die zyklischen Diester kein Efflux nach Co-Exposition festgestellt werden konnte. Der Transport scheint also in der Tat abhängig von der Struktur der PA, auch wenn die genaue Struktur-Transport-Beziehung insbesondere für offenkettige Diester noch geklärt werden muss. Darüber hinaus konnten die Microarray-Genexpressionsdaten eines früheren Sonderforschungsprojektes (1322-454) in HepaRG-Zellen verifiziert werden. Diese Zellen stellen daher ein geeignetes Modell für zukünftige Analysen bezüglich der strukturabhängigen Genregulation durch PA im humanen Hepatozyten dar. Die 3D-Kultiverung von HepG2-Zellen stellt hingegen kein geeignetes in vitro-Hepatozytenmodell dar. Erste Untersuchungen in verschiedenen 3D-Systemen (Kollagenachwich, Matrigel, Alvetex-Polystyrengerüst) stellen den Nutzen der hier eingesetzten 3D-Kultivierungssysteme in Frage, da die beobachteten Genexpressionssteigerungen von leberspezifischen Markerproteinen, fremdstoffmetabolisierenden Enzymen und Fremdstoffmetabolismus-assoziierten nukleären Rezeptoren und Transportern zeitabhängig auch in den 2D-Kontrollkulturen beobachtet werden konnten. Die strukturabhängige Interaktion der vier PA mit verschiedenen Rezeptoren wurde nur für VDR in einem VDR-vermittelten CYP3A4-Reportergenassay mit den vier PA analysiert. Es zeigten sich keine Effekte. Zusätzlich wurde jedoch eine Reihe weiterer Reportergenassays für zukünftige Analysen akquiriert, entwickelt und bereits teilweise etabliert und optimiert. Diese RGA sollen helfen strukturabhängige Interaktionen von PA mit nukleären Rezeptoren und zellulären Signalwegen aufzudecken.

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