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Die Rolle der Wirtsfaktoren NXF1, UAP56 und CAD im Replikationszyklus von Ebolaviren
Projekt
Förderkennzeichen: FLI-IMVZ-08-Ri-0581, 389002253
Laufzeit: 01.11.2017
- 30.01.2021
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Ebolaviren (EBOV) sind zoonotische Erreger, die schwere hämorrhagische Fieber verursachen können. Obwohl humanpathogene EBOV nur in Afrika vorkommen, hat der EBOV-Ausbruch 2014/2015 in West-Afrika vor Augen geführt, welche globalen Auswirkungen diese Viren haben können. Bis jetzt gibt es keine zugelassenen antiviralen Therapien, und Behandlungsmöglichkeiten sind auf unterstützende medizinische Maßnahmen beschränkt. Das Konzept, Wirtsfaktoren anstelle von viralen Faktoren als Ziele von antiviralen Therapien zu wählen, hat gegenüber dem klassischen Ansatz, direkt virale Faktoren anzugreifen, mehrere Vorteile. Die Entstehung von viralen Escape-Mutanten solllte bei einer auf den Wirt gerichteten antiviralen Therapie ausbleiben, und da oft auch weniger eng verwandte Viren gleiche Wirtsfaktoren für ihren Replikationszyklus verwenden, besteht die Möglichkeit, dass eine solche Therapie gegen ein breites Spektrum an Viren wirksam ist. Dies bedeutet nicht nur, dass eine solche Therapie auch gegen neu auftretende Viren helfen kann, sondern hat auch ökonomische und praktische Auswirkungen, insbesondere im Hinblick auf das Testen solcher Therapien, was bei seltener auftretenden Erkrankungen nur sehr schwer möglich ist. Um ein solches Konzept anwenden zu können, müssen wir aber unser Wissen über die Wirts-Virus-Schnittstellen, insbesondere im Hinblick auf grundlegende Aspekte des viralen Replikationszyklus wie z.B. der Genomreplikation, Transkription und Translation viraler mRNAs, deutlich erweitern. Aus diesem Grund haben wir einen Genom-weiten siRNA-Screen zur Identifikation von Wirtsproteinen, welche bei diesen Prozessen für EBOV eine Rolle spielen, durchgeführt. Drei dabei identifizierte Proteine sind NXF1, UAP56 und CAD, bei denen es sich um RNA-assoziierte Proteine bzw. Proteine der Nukleotidsynthese handelt. Wir schlagen vor, diese Wirtsproteine genauer auf ihre Rolle im Replikationszyklus von EBOV zu untersuchen. Dazu werden wir eine Reihe von Life-cycle-modelling Systemen einsetzen, die wir in den letzten 10 Jahren entwickelt haben, und die es erlauben, den Replikationszyklus von EBOV auch außerhalb eines Hochsicherheitslabors zu untersuchen. Komplementiert werden diese Studien durch den Einsatz von rekombinanten und wild-Typ EBOVs, um funktionelle und biochemische Interaktionen der Wirtsproteine mit EBOV näher zu untersuchen. Darüber hinaus werden wir den Einfluss von Wirtsproteinen auf virale Einschlußkörper beleuchten, welche wir kürzlich als Orte der Genomreplikation von EBOV identifizieren konnten (interessanterweise werden ähnliche Strukturen mit der gleichen Funktion auch für andere Viren beschrieben). Diese Studien werden einen wesentlichen Beitrag zu unserem Verständnis der Wirts-Virus-Schnittstelle von EBOV, und möglicherweise auch anderer RNA-Viren, beitragen, und haben das Potential, den Grundstein für die Entwicklung antiviraler Medikamente gegen EBOV und andere neu auftretende Infektionskrankheiten zu legen.
Ergebnisse
Virus-Wirt-Interaktionen von Ebolaviren mit zellulären Proteinen wurden mit einem breiten methodischen Ansatz untersucht, der Co-Immunopräzipitation, RNA-Co-Immunopräzipitation, Co-Immunofluoreszenz-Analyse, Reverse-Genetik-basierte Lebenszyklus-Modellierungssysteme und Infektionsexperimente unter Bedingungen der höchsten biologischen Sicherheitsstufe 4 umfasst. Mit dieser Strategie konnten wir für CAD und NXF1 die genaue Rolle entschlüsseln, die diese Wirtsfaktoren im Replikationszyklus des Ebolavirus spielen.
CAD (Carbamoyl-Phosphat-Synthetase 2, Aspartat-Transcarbamylase und Dihydroorotase) katalysiert die erste Reaktion in der de novo Pyrimidin-Synthese in der Zelle. Sowohl durch siRNA-Knockdown-Experimente als auch durch Studien mit chemischen Inhibitoren dieses Synthesewegs konnten wir zeigen, dass die de novo Pyrimidin-Synthese essentiell für den Replikationszyklus des Ebolavirus ist (Martin et al., 2018). Weiterhin konnten wir zeigen, dass CAD mit dem Ebolavirus-Nukleoprotein NP interagiert und in Einschlusskörper rekrutiert wird, welche virale Strukturen sind, die in infizierten Zellen induziert werden und die sich als Orte der viralen RNA-Synthese erwiesen haben (Brandt et al., 2020). Schließlich konnten wir durch eine Kombination von Replikationsszyklus-Modellsystemen und Substrat-Rescue-Experimenten zeigen, dass es tatsächlich die Funktion von CAD in der de novo Pyrimidin-Synthese ist, die sowohl für die Virusgenom-Replikation als auch für die Genom-Transkription essentiell ist.
NXF1 (nuclear export factor 1) ist der wichtigste Exportfaktor für mRNAs aus dem Zellkern. Da der Replikationszyklus des Ebolavirus jedoch vollständig außerhalb des Zellkerns stattfindet, war die genaue Funktion von NXF1 im Replikationszyklus des Ebolavirus, wie in einem genomweiten siRNA-Screen (Martin et al., 2018) gezeigt, rätselhaft. Mit einem ähnlichen Ansatz wie bei CAD konnten wir zeigen, dass NXF1 mit dem Ebolavirus-Nukleoprotein NP interagiert (Wendt et al., 2020). Interessanterweise war NXF1 auch in der Lage, mit viralen mRNAs zu interagieren, nicht aber mit genomischen RNAs, und es gab eine Konkurrenz zwischen RNA und NP in ihrer Bindung an NXF1. Genauere Untersuchungen zeigten, dass die RNA-Bindungsstelle und die RNA-Bindungsstelle von NXF1 miteinander interagieren. Coimmunofluoreszenz-Analysen zeigten, dass NXF1 in Einschlusskörper rekrutiert wird, aber nach der RNA-Bindung offenbar schnell wieder aus diesen Strukturen exportiert wird. Schließlich konnten wir mit Hilfe von Replikationszyklus-Modellierungssystemen zeigen, dass NXF1 zwar für die virale Proteinexpression, nicht aber für die Genomreplikation benötigt wird und dabei an einem Schritt beteiligt sein muss, der der viralen mRNA-Synthese nachgeschaltet, aber der viralen mRNA-Translation vorgeschaltet ist. Diese Ergebnisse erlaubten uns, ein Modell zu entwickeln, in dem NXF1 in Einschlusskörper rekrutiert wird, wo es mit NP interagiert und neugebildete mRNAs von NP übernimmt, was zu einem schnellen Export von NXF1:viralen mRNA-Komplexen aus diesen Strukturen führt, die dann für eine effiziente virale Proteinexpression zur Verfügung stehen. Dies definiert eine völlig neue Funktion von NXF1, die auch bei anderen Viren, die in Einschlusskörpern replizieren, von Bedeutung sein könnte. Details dieses Prozesses und eine mögliche Rolle von NXF1 für andere Viren werden nun in einem Folgeprojekt untersucht.
Brandt J, Wendt L, Bodmer BS, Mettenleiter TC, Hoenen T. 2020. The cellular protein CAD is recruited into Ebola virus inclusion bodies by the nucleoprotein NP to facilitate genome replication and transcription. Cells 9(5):E1126.
Martin S, Chiramel AI, Schmidt ML, Chen YC, Whitt N, Watt A, Dunham EC, Shifflett K, Traeger S, Leske A, Buehler E, Martellaro C, Brandt J, Wendt L, Müller A, Peitsch S, Best SM, Stech J, Finke S, Römer-Oberdörfer A, Groseth A, Feldmann H, Hoenen T. 2018. A genome-wide siRNA screen identifies a druggable host pathway essential for the Ebola virus life cycle. Genome Med 10(1):58.
Wendt L, Brandt J, Bodmer BS, Reiche S, Schmidt ML, Traeger S, Hoenen T. 2020. The Ebola virus nucleoprotein recruits the nuclear RNA export factor NXF1 into inclusion bodies to facilitate viral protein expression. Cells 9(1):187.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Tiergesundheit
- Biotechnologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
FLI - Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (FLI - IMVZ)
