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Selektive Detektion von Bakterien in Rohmilch mittels Durchflusszytometrie (Rohmilch-Mikrobiota)
Projekt
Förderkennzeichen: MRI-MBT-08-1040 Rohmilch-Mikrobiota
Laufzeit: 01.08.2018
- 31.07.2019
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Stichworte: Qualitätssicherung Milch, Durchflusszytometrie
Um generelle Aussagen zur Milchhygiene treffen zu können, ist die routinemäßige Erfassung des Parameters "Gesamtkeimzahl" unerlässlich und die Durchflusszytometrie ist als Methodik der Wahl in die Amtliche Sammlung nach § 64 LFGB aufgenommen worden. Zur Bearbeitung von Fragestellungen zur selektiven Detektion von Bakterien, wie z. B. Verderbniserregern, in Rohmilch werden Forschungsarbeiten mit dem vorhandenen Gerät BD FACSCalibur durchgeführt. Diese Untersuchungen umfassen u.a. Arbeiten zum Lebend-/Tot-Nachweis und dem Vorliegen von VBNC-Stadien, welche durch Kultivierungsmethoden nicht nachweisbar sind, und bei pathogenen Bakterien, wie Campylobacter von Bedeutung sind.
Um generelle Aussagen zur Milchhygiene treffen zu können, ist die routinemäßige Erfassung des Parameters "Gesamtkeimzahl" nach Milch-GüteVO unerlässlich und die Durchflusszytometrie ist seit 2000 als Methodik der Wahl in die Amtliche Sammlung nach § 64 LFGB aufgenommen worden. Allerdings lassen Gesamtkeimzahlen keinerlei Rückschluss auf das Vorhandensein einzelner problematischer Keimgruppen wie beispielsweise Pseudomonaden (Pseudomonas spp.) zu. Molkereien sind daher gezwungen, zusätzliche Untersuchungen durchführen zu lassen, die in Ermangelung von Alternativen in aller Regel über die klassischen kulturellen Nachweisverfahren mittels Selektivnährmedien erfolgen. Ziel des vorliegenden Projekts war es daher, die spezifische Detektion von Pseudomonaden in Rohmilch mittels Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dabei sollte geklärt werden, ob sich der Einsatz von Bakteriophagen als sog. „Biosensoren“ zum selektiven Schnellnachweis von Pseudomonaden in Rohmilch eignet. Zu diesem Zweck musste vorab die durchflusszytometrischen Analytik an die Matrix „Rohmilch“ etabliert werden. Hierbei wurden auch Versuche zur Bestimmung der bakteriellen Gesamtkeimzahl mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Durch die Kombination der beiden kulturunabhängigen Methoden, Durchflusszytometrie mit der 16S rDNA Amplikon-Sequenzierung, wird schließlich eine absolute Quantifizierung der Mikrobiomanalysen in Rohmilch ermöglicht. Um das Forschungsziel zu erreichen, ergaben sich daher folgende Arbeitsschritte und Ergebnisse: 1. Etablierung und Adaptierung der Rohmilch-Analytik mittels Durchflusszytometrie durch das Laborgerät BD FACSCalibur im Vergleich zur Routinemethode (BactoScan FC) und Referenzmethode (ISO 4833-1): Mit kommerziell erhältlichen Reagenzien wurde die Methodik zur Bestimmung der bakteriellen Gesamtkeimzahl in Rohmilch im Labormaßstab für das Laborgerät BD FACSCalibur erfolgreich etabliert. Diese Ergebnisse spielen im Folgenden für die Mikrobiomanalysen von Rohmilch mittels 16S rDNA-Amplikon-Sequenzierung eine große Rolle, die für weitere Fragestellungen auf andere Lebensmittelmatrices angepasst werden können. Die 16S rDNA-Amplikon-Sequenzierung gibt Aufschluss über die relativen Häufigkeiten verschiedener Bakteriengattungen in Form eines prozentualen Anteils einer Gesamtpopulation. Durch die methodische Kombination der 16S rDNA-Amplikon-Sequenzierung mit den durchflusszytometrischen Analysen, ist somit eine absolute Quantifizierung des Mikrobioms in Form von Keimzahlen möglich. 2. „Proof of Principle“ zum spezifischen Nachweis von Pseudomonas-Reinkulturen durch Phagen im Durchflusszytometer: Das „Proof of Principle“ zum spezifischen Nachweis von den getesteten Pseudomonas-Reinkulturen durch den Phagen PSteG-6 im Durchflusszytometer wurde erfolgreich durchgeführt und ein geeignetes Protokoll zur Fluoreszenzmarkierung von Phagen wurde entwickelt. Es wurden Experimente zur Stabilität der angefärbten Phagen bei Kühllagerung sowie zum Bindeverhalten des Phagens PSteG-6 an Pseudomonaden und weiterer Milch-relevanter Bakterien durchgeführt. Dabei wurden mittels Lebend/Tot-Färbung die Gesamtheit der vorhandenen Bakterien mit den Fluoreszenzfarbstoffen Syto 13 und Propidiumjodid (PI) gefärbt. Das Prinzip dieser Markierungsmethode beruht auf der Membranintegrität von Bakterien. Der lipophile Nukleinsäure-Fluoreszenzfarbstoff Syto 13 ist in der Lage die Zellmembran von Bakterien zu passieren und an der DNA zu binden. Die durch Syto 13-markierten, lebenden Zellen erscheinen dann grün. Hingegen wird die Zellmembran von toten Bakterien durch den DNA-bindenden, fluoreszierenden Farbstoff PI penetriert, so dass diese Zellen als rote Fluoreszenzsignale detektiert werden. Es bleibt zu prüfen, in wie weit die Spezifität der Methode durch die Verwendung von mehreren, geeigneten Phagen als Cocktail erhöht werden kann. Der Transfer des Phagen-basierten Prinzips zur durchflusszytometrischen Detektion von Pseudomonaden in die Matrix „Rohmilch“ war ebenfalls erfolgreich, wobei weitere Versuche zur Optimierung nötig sind. 3. Detektion von Pseudomonaden nach selektiver Anreicherung mittels Durchflusszytometrie: Der kulturelle Nachweis von Pseudomonaden erfolgt in der Regel mittels Selektivnährböden. Durch die Zusätze von Cetrimid, Fusidinsäure und Cephalosporin im CFC-Agar bzw. Cetrimid und Nalidixinsäure im CN-Agar wird die Begleitmikrobiota größtenteils gehemmt, so dass Pseudomonaden selektiv isoliert werden können. In den Versuchen wurden verschiedene Bakterien-Reinkulturen über 3 Stunden in CASO-Boullion in Anwesenheit bzw. Abwesenheit (Lebendkontrolle) von CFC-Supplement inkubiert. Im Anschluss daran wurde eine Lebend/Tot-Färbung mit PI und Syto 13 durchgeführt und die Gesamtheit der lebenden und toten Zellen im Durchflusszytometer ermittelt Erste Versuche zur durchflusszytometrischen Detektion von Pseudomonaden nach selektiver Anreicherung in Anwesenheit der Zusätze Cetrimid, Fusidinsäure und Cephalosporin waren erfolgreich. Weitere Untersuchungen zur Optimierung dieses Assay hinsichtlich der Inkubationsdauer, Konzentrationen der angewendeten Zusätze und ggf. Testung weitere Selektivsubstanzen sowie die Erweiterung des Paneels der zu untersuchenden Bakterien (verschiedene Pseudomonaden-Spezies/ -Stämme und Vertreter der nativen Mikrobiota von Rohmilch) sollten noch durchgeführt werden. Schlussendlich sollte der optimierte Assay dann mit der Matrix „Rohmilch“ in Form von künstlich mit Pseudomonaden beimpfter Rohmilch sowie Nativproben getestet werden. Im Verlauf dieses Projekts wurden auch weitere Anwendungsmöglichkeiten der Durchflusszytometrie in der Lebensmittelmikrobiologie recherchiert, bei welchen die kulturunabhängige und schnelle Detektion der Bakterienzellzahl von Nutzen sein kann. Beispielsweise erlaubt die Kombination von klassisch-mikrobiologischen, kulturabhängigen Verfahren mit fluoreszenzoptischen Techniken Aussagen zum Zellstatus und zur Lebensfähigkeit von Bakterien und Rückschlüsse auf das Vorhandensein von „viable but non-culturable“ (VBNC) Zellstadien. Diese und weitere Fragestellungen zum Phagen-basierten Nachweissystem mittels Durchflusszytometrie werden im Folgeprojekt „Flow-Food“ weiterbearbeitet.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Verfahrenstechnik Lebensmittel
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
MRI - Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie (MRI-MBT)
