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Etablierung von lateral flow assays als Schnellmethoden zum Nachweis der Schnapper-Arten Lutjanus malabaricus (Red Snapper) und Lutjanus bohar (Doppelfleckschnapper)

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-NRZ-08-1050 LFA Schnellmethoden
Laufzeit: 01.02.2019 - 30.06.2020
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Stichworte: Red Snapper, Lutjanus malabaricus, Lutjanus bohar, molekularbiologischer Authentizitätstest

Fischereierzeugnisse werden global gehandelt und die Verbraucherinnen und Verbraucher in Deutschland können aus einer großen Artenvielfalt auswählen. Exotische Arten wie die in Deutschland unter dem Namen Red Snapper vermarktete Schnapperspezies Lutjanus malabaricus erfreuen sich immer größerer Beliebtheit. Untersuchungen des Max Rubner-Instituts und der amtlichen Lebensmittelüberwachung haben allerdings gezeigt, dass unter der Handelsbezeichnung Red Snapper häufig andere Spezies wie z.B. der Doppelfleckschnapper (L. bohar) verkauft werden. Dabei wurde der Verzehr von als Red Snapper ausgezeichneten Doppelfleckschnapper-Produkten in den letzten Jahren in Deutschland wiederholt mit Ausbrüchen der ernsten Fischvergiftung Ciguatera in Verbindung gebracht. Eine Authentizitätsprüfung von Red Snapper-Produkten ist somit ein erster Schritt, um Ciguatera-Erkrankungen zu verhindern. Die Überprüfung der Spezies wird in der Regel durch eine PCR mit einer nachfolgenden Sequenzierung und einem Abgleich der DNA-Sequenzen mit Sequenzeinträgen in öffentlichen Datenbanken durchgeführt. Dieses Verfahren ist vergleichsweise langwierig, insbesondere weil viele Laboratorien die Sequenzierungsreaktionen von spezialisierten Dienstleistungsunternehmen durchführen lassen und durch das Verschicken der PCR-Produkte wertvolle Zeit verloren geht. Somit vergehen bis zur Befunderstellung oftmals mehrere Tage. Als Alternative sollen in diesem Projekt schnelle Verfahren etabliert werden, mit deren Hilfe die Arten L. malabaricus und L. bohar durch speziesspezifische DNA-Amplifikationsmethoden und eine Detektion der Amplikons mit Hilfe von lateral flow dipsticks nachgewiesen werden. Diese Verfahren sollen in maximal zwei Stunden ohne aufwändige Geräte und ohne Expertenwissen durchzuführen sein.

Im Vorfeld der Entwicklung von Schnellmethoden für relevante Schnapper-Arten wurden die DNA-Sequenzdaten von Schnappern (Lutjanidae), die in der öffentlichen Datenbank GenBank des NCBI (USA) vorlagen, auf ihre Eignung für die DNA-Sequenz-basierte Speziesüberprüfung untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Sequenzdaten vieler Schnapperarten inklusive der in Deutschland unter dem Namen Red Snapper vermarkteten Art L. malabaricus uneindeutig und widersprüchlich bezüglich der Angabe der wissenschaftlichen Art sind. Eine Sequenzgruppe mit der Annotation von L. malabaricus, die auch durch eine Referenzsequenz aus der Reference Standard Sequence Library (RSSL) for Seafood Identificaton der U. S. Food and Drug Adminstration (FDA) unterstützt wird, wurde als sehr wahrscheinlich authentische Sequenzgruppe für den Red Snapper identifiziert. Die Ergebnisse der Datenbankanalyse wurden in Food Control publiziert.  Darüber hinaus wurden die DNA-Sequenzalignments sowie phylogenetischen Bäume für die weitere öffentliche Nutzung zur forensically informative nucleotide sequencing (FINS)-basierten Speziesbestimmung bei Schnapper-Proben in dem öffentlichen Repository Mendeley Data hinterlegt. 
Die Amplifikationsmethoden Polymerase-Kettenreaktion (PCR), loop-mediated isothermal amplification (LAMP) und recombinase polymerase amplification (RPA) wurden zum Projektbeginn zunächst auf Basis von Literaturdaten auf Vor- und Nachteile für die Etablierung von einfachen Schnellmethoden zum Fischartennachweis überprüft. Es stellte sich heraus, dass die LAMP gegenüber der PCR und der RPA zwei entscheidende Vorteile aufweist: Sie ist zum einen besonders spezifisch und zum anderen können die Amplifikations-Produkte durch Zugabe von Farbstoffen auch mit dem bloßen Auge detektiert werden, so dass der Nachweis der Fischart besonders einfach, schnell und kostengünstig geschehen kann. Daher wurde entschieden, statt drei Amplifikationsmethoden in Verbindung mit einem Teststreifen (lateral flow dipstick, LFD) zu testen, ausschließlich LAMP-Systeme zu entwerfen und diese zusätzlich zu einem LFD auch mit einem Farbnachweis zu etablieren.
Da sich nach dem Einkauf von Probenmaterial herausstellte, dass unter der Handelsbezeichnung Red Snapper besonders häufig Exemplare der Schnapper-Art Lutjanus argentimaculatus (Mangroven- oder Kupferschnapper; keine eigene Handelsbezeichnung)  gehandelt werden, wurde dieses Projekt auf diese Spezies ausgeweitet, die ebenfalls wie der Doppelfleckschnapper mit einer höheren Ciguatera-Gefahr assoziiert ist. Die Arbeiten zur Entwicklung der Kupferschnapper-spezifischen LAMP-Systeme sind in einer Masterarbeit beschrieben.
Für die Arten Red Snapper, Doppelfleckschnapper und Kupferschnapper konnten jeweils zwei verschiedene LAMP-Systeme entworfen werden, die durch Zugabe des Farbstoffes Hydroxynaphtholblau (HNB) zum Reaktionsansatz anhand eines mit dem bloßen Auge sichtbaren Farbumschlags und/oder die Anwendung eines kommerziellen Teststreifens (GenLine HybriDetect 2T; Milenia Biotec) ausgewertet werden können. Die Analytik ist einfach durchzuführen und an Geräten wird außer einem Pipettensatz nur ein Heizblock benötigt. Insgesamt dauert die Analytik mit einer für die Extraktion der DNA aus der Probe vorgeschalteten Schnellmethode unter zwei Stunden. Mit einer konventionellen DNA-Extraktionsmethode beträgt die Zeitdauer der Methode entsprechend länger. Die Spezifität von vier der sechs entworfenen LAMP-Systeme wurde mit Probenmaterial der drei Zielarten (34 Tests, 100 % richtig-positive Ergebnisse) sowie weiterer 22 Spezies aus der Ordnung der Barschartigen (Perciformes) überprüft. Dabei reagierte das Red Snapper-spezifische LAMP-System auch mit drei von sechs Proben einer sehr eng verwandten Art, die nur auf Gattungsebene als Lutjanus sp. bestimmt werden konnte. Eines der beiden für den Kupferschnapper entworfenen Systeme wies auch bei einer von zwei untersuchten Papageifischproben ein falsch-positives Ergebnis auf. Alle weiteren getesteten Nichtzielart-Proben zeigten keinen Farbumschlag bzw. keine Reaktion an der LFD-Testbande (insgesamt 151 Tests, 97,4 % richtig-negative Ergebnisse).
Die Sensitivität wurde auf 10 pg an eingesetzter DNA-Menge eingeschätzt. Bei der Anwendung von kommerziellen Schnellmethoden zur DNA-Extraktion, bei denen die Konzentration der extrahierten DNA nicht bestimmt wird, kam es zusätzlich bei einer der beiden untersuchten Kupferschnapper-spezifischen LAMP-Systems zu falsch-positiven Ergebnissen bei einer Nichtzielart (Lutjanus sp.), die vorab negative Ergebnisse gezeigt hatte. Hier wird vermutet, dass die eingesetzte DNA-Konzentration eine entscheidende Rolle für die Spezifität der Systeme spielt. Bei der Untersuchung von typischen Red Snapper-Marktproben (bezogen von Internethändlern) reagierten die Red Snapper- und Doppelfleckschnapper-spezifischen LAMP-Systeme richtigerweise mit keiner der Proben. Das verwendete Kupferschnapper-spezifische LAMP-System zeigte drei richtig-positive aber auch zwei falsch-positive Reaktionsergebnisse (bei zwei von vier Lutjanus johnii-Exemplaren). Durch eine Optimierung der Reaktionstemperatur konnten diese unspezifischen Reaktionen jedoch bei Wiederholungsexperimenten unterbunden werden.
Zusätzlich zum Farbumschlag mit HNB wurde am Ende des Projekts eine Detektion der LAMP-Produkte mit einem pH-sensitiven Farbstoff (Kresolrot) etabliert, der eine bessere Bewertung durch einen stärkeren Farbunterschied bei positiven und negativen Ergebnissen erlaubt.
Insgesamt haben die hier entwickelten LAMP-Systeme das Potenzial, zuverlässig die entsprechenden Arten zu erkennen. Allerdings müssen weitere Optimierungsarbeiten zur Verbesserung der Spezifität durchgeführt werden, bevor die LAMP-Systeme für die Lebensmittelanalytik als Screening-Methoden eingesetzt werden können. Hier wären vielversprechende Ansätze, die eingesetzte DNA-Menge zu reduzieren und/oder die Reaktionszeit zu verkürzen. Auch eine Anhebung der Reaktionstemperatur kann die Spezifität steigern, hier wurden jedoch erst wenige Versuche angefangen, bevor das Projekt beendet war. Auch wäre der Versuch zweckmäßig, die Reaktionsbedingungen für die verschiedenen LAMP-Systeme zu vereinheitlichen, damit eine Schnapper-Probe gleichzeitig im selben Heizblock auf alle drei Arten getestet werden kann.
Aufgrund der großen Produktmenge ist die LAMP sehr anfällig gegenüber Kontaminationen. Von daher ist die Detektion durch einen Farbstoff wie HNB, der dem Reaktionsansatz bereits hinzugegeben werden kann, dem Nachweis durch einen LFD vorzuziehen, bei dem das Reaktionsgefäß nach Reaktionsende noch einmal geöffnet werden muss. Der LFD ist jedoch bezüglich der Beurteilung des Ergebnisses einfacher, weil der HNB-vermittelte Farbumschlag nicht immer gleichbleibend stark und zudem nicht sehr gut zu dokumentieren war. Hier wäre es sinnvoll, weitere Versuche mit dem Farbstoff Kresolrot durchzuführen, der einen sehr viel deutlicheren Farbumschlag bewirkt. Eine weitere Alternative für die Vermeidung von Kreuzkontaminationen stellt die Entwicklung von geschlossenen Reaktionssystemen dar, wie z. B Mikrofluidik-basierte Lab-on-a-Chip-Systeme, bei denen die Probe nach Einbringen in das System ohne weitere Interaktion von außen prozessiert und ausgewertet wird.
Eine Publikation über die Entwicklung der LAMP-Systeme ist geplant.

Literatur:
1) Kappel, K., & Schröder, U. (2020). Difficulties in DNA barcoding-based authentication of Snapper products due to ambiguous nucleotide sequences in public databases. Food Control, 118, 107348. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2020.107348.
2) Kappel, K., & Schröder, U. (2020), Sequence alignments and neighbour joining trees of public DNA sequences with annotations of Lutjanidae species. Mendeley Data, v1. http://dx.doi.org/10.17632/82zb9mc7gb.1
3)  Interwies, T. (2020). Entwicklung und Validierung eines Loop-mediated Isothermal Amplification-Verfahrens (LAMP) zum Nachweis des Mangroven-Schnappers (Lutjanus argentimaculatus). Master Thesis. Studiengang Biotechnology and Process Engineering, Hochschule Flensburg.

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