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Optimierung der CRISPR-Cas-Effizienz in Rabl-konfigurierten Getreide-Genomen (CrisBar)

Projekt


Förderkennzeichen: 031B0551
Laufzeit: 01.07.2018 - 30.06.2020
Fördersumme: 456.778 Euro
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Stichworte: Gerste, Weizen, Rabl Struktur, Hochdurchsatz-Methoden

Gen Editierung mittels CRISPR-Cas macht weiter, wo die klassische Genetik aufhört. Nun können mechanistische Studien auch in Organismen mit schwer zugänglichen Genomen, wie zum Beispiel Gerste und Weizen, durchgeführt werden. Das Ziel des CrisBar Projektes ist die Etablierung von Hochdurchsatz-Methoden für die Auswahl von Zielsequenzen, das Design von effizienten sowie hoch-spezifische gRNAs und dessen Screening auf Mutageneseeffizienz und mögliche Phänotypen, die mit der pflanzliche Immunität zusammenhängen. CrisBar spezialisiert sich dabei auf Gerste und vor allem Weizen. CrisBar nutzt rezent etablierte bioinformatische Resourcen für die Auswahl einer nicht zuvor realisierbaren Anzahl von mehr als 1000 CRISPR-Cas Ziel Sequenzen und deren assoziierten gRNAs in Gerste und Weizen. Die Zielsequenzen werden entlang die sogenannte Rabl Struktur der Getreide Chromosomen gewählt, um so den Effekt von der Platzierung von Zielsequenzen für die CRISPR-Cas Mutageneseeffizienz festzustellen. Darüber hinaus werden Zielsequenzen in verschiedenen genomischen und Sequenz-Hintergründen gewählt und in Weizen vor allem auch auf deren subgenomischen Spezifizität getestet. CRISPR-Cas Mutationsraten werden in Protoplasten, die mit Reporter- und CRISPR-Cas Vektoren transformiert werden, bestimmt. Klonierung von Ziel Sequenzen und gRNAs in den entsprechenden Vektoren sowie das auf Fluoreszenz basierte Screening der CRISPR-Cas Mutageneseeffizienz sollen in der automatisierten hoch Durchsatz konfokale Mikroskopie Anlage SignalSCREEN etabliert werden. Weitere bioinformatische Ansätze werden verwendet, um Anforderungen für die Auswahl von Zielsequenzen sowie die Sequenz von effizienten und hochspezifischen gRNAs zu bestimmen. Darüber hinaus soll in SignalSCREEN eine Phänotypisierung von Merkmalen der pflanzlichen Immunität in CRISPR-Cas mutagenisierten Protoplasten etabliert werden, die die Auswahl von Ziel Sequenzen, die mit relevanten Phänotypen assoziiert sind, deutlich erleichtern soll. Damit erweitert dieses Projekt die Anwendungen der im Rahmen des BMBF-geförderten Deutschen Pflanzen-Phänotypisierungs-Netzwerks etablierte SignalSCREEN Platform auf CRISPR/Cas-relatierte Anwendungen in Protoplasten. Die Kombination von CRISPR-Cas Mutagenese und Phänotypisierung von Stress-relatierte Merkmalen in Protoplasten könnte die Notwendigkeit Pflanzen stabil zu mutieren verringern und somit Züchtungsprozessen unterstützen.

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