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Etablierung verschiedener Zelllinien zur Detektion epigenetischer Veränderungen in Einzelzellauflösung

Projekt


Förderkennzeichen: BfR-CPS-08-1322-696
Laufzeit: 01.01.2018 - 31.12.2019
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Epigenetische Mechanismen sind besonders in der frühen Embryonalentwicklung von entscheidender Bedeutung. Und auch wenn das Verständnis um die molekularen Grundlagen wächst, sind wir noch weit davon entfernt, zu verstehen, welche Konsequenzen aus einer Fehlregulation entstehen können. Obwohl toxikologisch hochrelevant gibt es bisher weder ein in vivo- noch ein in vitro-Testsystem, um auf epigenetische Noxen zu testen. Dies liegt v. a. daran, dass bisher noch kein hinreichend eindeutig und universeller Endpunkt/Biomarker für epigenetische Störungen identifiziert werden konnte. Ziel dieses Projektes ist es daher Indikatorzelllinien zu entwickeln mit deren Hilfe spezifische epigenetische Prozesse während der Differenzierung auf Einzelzellbasis aufgeklärt und untersucht werden können, um so zusammen mit den anderen Arbeiten am BfR eine molekulare Grundlage für die Identifizierung und Abfrage eines solchen Endpunktes zu schaffen. Die zwei am besten untersuchten epigenetischen Mechanismen umfassen DNA-Methylierung und Histonmodifikationen. In beiden Fällen ist die Analyse sehr arbeitsaufwendig und invasiv, so dass jeweils nur ein momentaner Zustand betrachtet und analysiert werden kann. Besonders bei der Differenzierung erschwert zudem die Entstehung komplexer Zellgemische die Interpretation der Daten. Die beiden Ansätze sollen im Folgenden erklärt und der momentane Stand der Arbeiten umrissen werden. Zwei kürzlich in Cell erschienene Arbeiten zeigen, dass Reportermäuse in denen die Expression eines fluoreszierenden Proteins durch die Methylierung einer spezifischen endogenen DNA-Sequenz gesteuert wird, dazu genutzt werden können in lebenden Mäusen den endogenen Methylierungszustand der entsprechenden Regionen zu betrachten (Stelzer et al. 2015 und 2017). Im vergangen Jahr wurde ausgehend von diesen Arbeiten am BfR die Idee eines Reportersystems entwickelt und entsprechenden Konstrukte stabil in embryonale Stammzellen eingebracht. Dabei handelte es sich um 400 bis 500bp große Fragmente eines konstitutiv aktiven Promotors des Gens Pgk1 und den starken, normalerweise inaktiven Promoter des Intracisternen A-Partikel (IAP). Die stabile Integration zeigte leider, dass die Inaktivierung des IAP-Konstruktes nicht zuverlässig funktionierte, vermutlich aufgrund einer zu kurzen endogenen Sequenz (Lienert et al., 2011). Die Arbeiten sollen daher nun mit auf 1000 bp verlängerten Fragmenten fortgeführt werden. Der zweite Ansatz ist die Sichtbarmachung spezifischer Histonmodifikationen, welche zumeist die Zugänglichkeit der DNA beeinflussen. DNA ist im Zellkern immer um Histone gewunden. Diese globulär aufgebauten Proteine haben lange N-terminale Enden an denen verschiedenste Proteinmodifikationen, wie zum Beispiel Phosphorylierung, Methylierung und Acetylierung wirken können. Auf die umliegenden Genbereiche wirken diese Modifikationen, je nach Position und Art, aktivierend oder reprimierend. Klassische Vertreter sind zum Beispiel die Histonmodifikation H3K4me3, die hauptsächlich in der Promoterregion aktiv abgelesener Gene zu finden ist, und H3K27me3, die die Expression der entsprechenden Gene reprimiert. Interessanter weise schließen sich diese Modifikationen in allen somatischen Zellen gegenseitig aus. In embryonalen Stammzellen finden sich dagegen auch sogenannte bivalente Promotoren, welche beide Histonmodifikationen aufweisen, sich in einem geöffneten, leicht zugänglichen Zustand befinden aber dennoch transkriptionell inaktiv sind. Der komplexe Zusammenhang verschiedener Histonmodifikationen und ihrer übergeordneten Wirkung auf die Transkription wird auch der Histon-Code genannt und die Zellen besitzen viele verschiedene Reader-Proteine, welche spezifische Histonmodifikationen erkennen können. Es wurden daher nun Fusionsproteine kreiert, die durch ein Reader-Protein (bzw. der entsprechenden Domäne), die entsprechenden Modifikationen erkennen, und an ein rotfluoreszierendes Protein, mCherry, gekoppelt sind. Erste Proof-of-Concept-Analysen mit parallel durchgeführte Antikörperfärbungen zeigen die Funktionstüchtigkeit und Spezifizität des Konzeptes. Lediglich das H3K4me3-erkennenden Protein hat derzeit noch einen relativ hohen Fluoreszenzhintergrund. Eine entsprechende Optimierung ist für das laufende Jahr vorgesehen. Grundsätzlichen sollen nun auch die Langzeitstäbilität des Systems untersucht und analysiert werden ob die Konstrukte mit der Zellviabilität interferieren, ferner ob eine Detektion in lebenden Zellen über einen längeren Zeitraum möglich ist. Für die eigentlichen Zelllinien soll dann das mCherry durch bipartite Fluoreszenzproteine ersetzt werden, die entsprechend auch die direkte räumliche Nähe der Histonmodifikationen anzeigen. Anschließend sollen stabile Zelllinien generiert werden, mit deren Hilfe zum Beispiel der Einfluss potentieller epigenetischer Noxen auf die betrachteten Histonmodifikationen funktionell analysiert werden kann.

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