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Applikation der Durchflusszytometrie in der Lebensmikrobiologie
Projekt
Förderkennzeichen: MRI-MBT-08-1040 FlowFood2020
Laufzeit: 01.09.2019
- 31.08.2021
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Seit den letzten 10 Jahren zeigt sich die Durchflusszytometrie auch in der Lebensmittelmikrobiologie als leistungsstarkes Werkzeug, um Bakterienpopulationen auf Zellebene schnell zu analysieren. Erste Applikationsmöglichkeiten dieser Technik wurden am MBT bereits untersucht. So wurde die durchflusszytometrische Analyse zur Bestimmung der bakteriellen Gesamtkeimzahl im Labor an die Matrix „Rohmilch“ etabliert. Durch die Kombination der beiden kulturunabhängigen Methoden, Durchflusszytometrie mit der 16S rDNA Amplikon-Sequenzierung, wird eine absolute Quantifizierung der Mikrobiomanalysen in Rohmilch ermöglicht. Diese Art der Analyse soll nun auf weitere komplexe Bakteriengemeinschaften in verschiedenen Lebensmitteln und auf das Darmökosystem angepasst und angewendet werden. Des Weiteren soll der Einsatz von Bakteriophagen als Biosensoren für ausgewählte Bakterien (Verderbniserreger, Pathogene) untersucht, optimiert und angepasst werden. Weitere Analysen sollen zudem Aufschluss über den Infektionszyklus spezifischer Phagen/Bakterien-Kombinationen geben. Ein weiteres Ziel ist die Anwendung der Durchflusszytometrie zum Nachweis von sog. viable but not culturable (VBNC) Zellstadien von Lebensmittelinfektionserregern. Mit kulturabhängigen Verfahren sind diese nicht nachweisbar und es kann in der Routinediagnostik zu falsch negativen Ergebnissen kommen. In der Regel wird eine Inaktivierung oder Abtötung von Bakterien durch den Einfluss von externen Stressoren, wie beispielsweise Hitze, Hochdruck oder antimikrobiellen Substanzen, klassisch-mikrobiologisch über kulturabhängige Verfahren nachgewiesen. Die Kombination mit fluoreszenzoptischen Techniken erlaubt darüber hinaus Aussagen zum Zellstatus und zur Lebensfähigkeit von Bakterien. Deshalb soll unter lebensmittelrelevanten Bedingungen die Generierung von VBNC Zellstadien von Lebensmittelinfektionserregern, wie beispielsweise Listeria monocytogenes untersucht werden. Die VBNC Zellen sollen dann im Hinblick auf Revitalisierungbedingungen, mRNA-Expression und Infektiosität im Zellkulturmodell charakterisiert werden. Für die Erreichung dieser Ziele arbeiten am MBT alle Arbeitsgruppen eng zusammen. Die Durchflusszytometrie kann der Lebensmittelmikrobiologie vielfältig eingesetzt werden und bietet von allem im Bereich der Lebensmittelinfektionserreger die Möglichkeit von fluoreszenzoptischen Analysen auf Zellebene. Diese Technik kann daher zusammen mit molekularbiologischen und mikrobiologischen Methoden zur Erhöhung der Lebensmittelsicherheit und –qualität beitragen.
Seit den letzten 10 Jahren zeigt sich die Durchflusszytometrie auch in der Lebensmittel-mikrobiologie als leistungsstarkes Werkzeug, um Bakterienpopulationen auf Zellebene schnell zu analysieren. Ziel des Projekts ist es, diese Methodik auf folgende, unterschiedliche Fragestellungen anzupassen.
- Arbeitspaket 1: Bestimmung der absoluten, bakteriellen Gesamtkeimzahl
Die Zellvitalitätsprüfung mittels Lebend-Tot-Assay basierend auf den Fluoreszenzfarbstoffen Propidiumjodid und Syto 13 wurde etabliert, so dass sowohl der physiologische Status als auch die absolute Bakterienkonzentration sehr schnell bestimmt werden können. Mit einigen Anpassungen im Versuchsdesign wurden erfolgreich Bakterien in verschiedenen Lebensmittelmatrizen, wie Fleischtropfsaft und Milch, quantifiziert.
- Arbeitspaket 2: Phagen als Biosensoren
Eine schnelle und einfache Methode zur Fluoreszenzmarkierung von Bakteriophagen wurde etabliert. Mit dem markierten Bakteriophagen (PMBT14) wurde ein Protokoll zur spezifischen Fluoreszenzmarkierung der Zielbakterien (Pseudomonas fluorescens DSM 50090) optimiert. Anfängliche Probleme bezüglich geringer Bindungsspezifität konnten gelöst werden, indem die Puffer und das Inkubationsprotokoll schrittweise verbessert wurden. Es ist nun möglich, die Wirtsbakterien, welche durch die spezifische Bindung der Fluoreszenz-gelabelten Phagen markiert wurden, mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie von anderen Bakterien zu unterscheiden. Neben der Verwendung dieser markierten Bakteriophagen als Biosensoren zur spezifischen Identifizierung von Bakterien, ist diese Technologie auch in anderen Bereichen anwendbar. Beispielsweise ist die Methode zur fluoreszierenden Markierung von Bakteriophagen sehr leicht auf andere Arten von Viren übertragbar und könnte bei Studien zur Interaktion zwischen Virus und Wirt hilfreich sein. Außerdem könnten bei Fragestellungen zur Biokontrolle oder Phagentherapie markierte Bakteriophagen, die an Bakterien binden und diese infizieren, als Schnellmethode dienen, um eine Phagentypisierung durchzuführen.
- Arbeitspaket 3: Detektion und Charakterisierung von VBNC Zellstadien L. monocytogenes
Bei Versuchen veröffentlichte Daten zu replizieren und den „viable but non culturable“ (VBNC) Zustand in L. monocytogenes zu induzieren, wurden zunächst sog. „Starvation-Experimente“ durch „Aushungern“ der Zellen in Wasser durchgeführt. Ein solcher Prozess dauert über mehrere Monate, somit sind diese Versuche sind sehr zeitintensiv. Die Detektion der VBNC-Zellstadien erfolgte mittels Durchflusszytometrie unter Anwendung eines Lebend/Tot-Fluoreszenzfärbeverfahrens mit Propidiumjodid, welches die Membranintegrität bestimmt. Nachdem bei diesen Versuchen erste Erfahrungen gesammelt wurden, wurde deutlich, dass alternative und schnellere Methoden zur Induzierung sowie Detektion des VBNC-Zustands in L. monocytogenes etabliert werden sollen. Deshalb wurde als weiterer Fluoreszenzfarbstoff CFDA-SE eingesetzt, um die Lebensfähigkeit einer Zelle über die Esteraseaktivtiät zu detektieren. Zudem werden Glukoseaufnahmetests unter Verwendung des fluoreszierenden Glukoseanalogons 2-NBDG getestet. Unter Verwendung der verfügbaren Assays werden dann verschiedene Desinfektionsmittel bei suboptimaler Verwendung getestet, um den VBNC-Zustand in L. monocytogenes zu induzieren.
Ein Zellkulturmodell mit humanen Caco-2-Adenokarzinomzellen zum Nachweis der Infektiosität von L. monocytogenes konnte erfolgreich etabliert werden, wobei Unterschiede in der Zellmorphologie zwischen invasiven und nichtinvasiven Listerien-Stämmen beobachtet wurden. Weitere Experimente zur Bestimmung der Infektiosität von VBNC-Zellstadien müssen noch durchgeführt werden.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Lebensmittelmikrobiologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
MRI - Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie (MRI-MBT)
