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Die Wirkung von TiO2-Nanopartikeln auf das metabolische Expressionsprofil von kultivierten Darmzellen

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-MF-08-105
Laufzeit: 01.04.2012 - 31.03.2014
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Im Rahmen der Untersuchungen zur Gefährdungsabschätzung von Nanopartikeln in Lebensmittel soll untersucht werden, welchen Einfluss Nanopartikel auf die Expression von Entzündungs- und Toxizitätsrelevanten Genen in Darmzellsystemen haben. Durch vorausgegangene Experimente ist deutlich geworden, dass die Nanopartikel möglichweise auf besondere Weise den Zellen zugeführt werden müssen. Dazu sind einige Untersuchungen notwendig. Ein weiterer Aspekt ist die genauere Untersuchung des P450 Entgiftungssystem, welches möglicherweise über einen bisher weitgehend unbekannten Weg der Expressionsregulation gesteuert wird. Die Untersuchung weiterer Gene, die für eine Abschätzung der Toxizität, die Kanzerogenät bzw. des inflammatorischen Potentials relevant sind, werden ebenfalls im Rahmen dieses Projektes durchgeführt. Dazu ist die Entwicklung von real-time PCR arrays notwendig, um eine hohe Anzahl von Genen mit vertretbarem Aufwand untersuchen zu können. Sobald Gene bzw. Genfamilien identifiziert sind sollen in weiteren Untersuchungen diese Befunde mittels proteinbiochemischer Analytik und manipulativer Gentechnik (siRNA) bestätigt werden, um die metabolischen Wege der Genexpreessionsregulation zu beschreiben.

Es wurden TiO2 Partikel in vier unterschiedlichen Größen (5nm, 10nm, 32nm, 490nm) verwendet. Eine Charakterisierung der Partikel mittels Transmission Elektronenmikroskopie (TEM), Statischer Lichtstreuung (SLS) sowie Dynamischer Lichtstreuung (DLS) zeigte bei den kleinsten Partikeln (5nm und 10nm) einen Agglomerationseffekt, während die größeren Partikel nur kleine oder keine Agglomerate aufwiesen. Als Model intestinaler Epithelien diente die humane Caco-2 Zelllinie, da diese ausdifferenziert Eigenschaften von Dünndarmzellen aufweisen. Die ersten Untersuchungen zeigten keinen Einfluss der kleinsten Partikel auf die Differenzierung von Caco-2 Zellen. Die Expression des Enzyms Sucrose Isomaltase sowie des Krüppel-like Faktors 4 als Differenzierungsmarker von Caco-2 Zellen wurden nicht durch TiO2 NPs beeinflusst. Im Folgenden konnte eine Aktivierung inflammatorischer Signalwege nachgewiesen werden. NP von 5 und 10nm Größe erhöhten die mRNA Expression von ICAM1, CCL20, COX2 und IL8, während die größeren Partikel keinen Effekt zeigten. Um Aufschluss über eine mögliche Aktivierung des Nuklear Faktor(NF)-kB Signalweges zu finden, wurde eine stabile Caco-2 Zelllinie etabliert, die in Abhängigkeit vom NF-kB Response Element Luciferase expremiert. Damit konnte gezeigt werden, dass die NP induzierte IL8 mRNA Expression über eine Aktivierung von NF-kB und p38 Mitogen aktivierte Protein Kinase (MAPK) erfolgt. Eine Inhibierung der IkB-alpha sowie p38 MAPK Aktivierung führte zu einer verminderten IL8 mRNA Expression. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass TiO2 NP vor allem endocytotisch aufgenommen werden. Die Inhibition von Dynamin, einer GTPase, die an der Abschnürung von neu gebildeten Vesikeln beteiligt ist, bewirkt eine geringere NP Aufnahme. Weiter zeigte sich, dass für den intrazellulären Weitertransport der Vesikel Aktinfilamente und Mikrotubuli essentiell sind. Die Ergebnisse zur Inhibierung des Epidermal-Growth-Factor (EGF) Rezeptors zeigten zudem eine Reduktion der NP induzierten NF-kB Aktivierung. Diese Ergebnisse sprechen für eine Aufnahme der NP in Caco-2 Zellen über eine EGFR-vermittelte dynaminabhängige Endocytose.

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