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Anpassung der Genexpression verschiedener zoonotischer Brucella Spezies an die Stressbedingungen im Wirt und unter Umwelteinflüssen

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-BIOS-08-1329-452
Laufzeit: 01.12.2010 - 30.09.2012
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Die Brucellose ist eine weltweit vorkommende 're-emerging' Zoonose. Die Infektion wird durch eine Vielzahl unterschiedlicher Brucella Spezies hervorgerufen, die genetisch sehr nah verwandt sind. Allerdings bestehen ausgeprägte Unterschiede in der Tenazität, Pathogenität und Wirtsspezifität der Erreger. Für diesen scheinbaren Widerspruch zwischen Genotypie und Phänotypie der Brucella spp. werden Genregulationsmechanismen und metabolische Adaptations-vorgänge verantwortlich gemacht. Brucella spp. dienen in dem geplanten Projekt als Modellerreger einer bakteriellen zoonotischen Erkrankung mit der Besonderheit, dass die einzelnen Spezies ganz unterschiedliche Tierreservoire besitzen, wodurch die Identifikation spezifischer Regulationsprozesse erfolgversprechender erscheint. Im Rahmen des Forschungsvorhabens sollen die Expressionsprofile der homologen Spezies B. microti und B. suis (99,84 %-ige Genomsequenzübereinstimmung) im pH-Stressmodell vergleichend analysiert werden. In Abhängigkeit vom pH-Wert werden nährstoffarme intrazelluläre Bedingungen im Wirt und Umweltbedingungen simuliert. Bei B. microti handelt es sich um eine erst kürzlich neu beschriebene Spezies, welche im Vergleich zu den bisher bekannten klassischen Spezies auch in Habitaten außerhalb von Säugetieren nachgewiesen werden konnte. Die Isolation von B. microti aus Bodenproben stellt ein noch nicht einschätzbares Risiko für Mensch und Tier dar, da dieses Reservoir mit unbekannten Übertragungswegen einhergehen kann. B. microti ist wesentlich säureresistenter als die bisher bekannten Spezies, so dass ein Überleben in Käse trotz Reifungsprozess und in Lebensmitteln trotz Konservierung möglich scheint. Außerdem zeigte sich diese neue Spezies im Maus-Infektionsmodell sehr virulent. Die Transkriptom-Analysen sollen mit Hilfe einer Gesamt-RNA-Sequenzierung (Illumina/Solexa-Methode) mit sehr hohem Durchsatz erfolgen. Im Vergleich zu den Hybridisierungsmethoden mittels DNA-Microarray können dadurch Transkripte ohne a priori-Kenntnis ihrer Sequenz ana-lysiert, ein sehr breites Spektrum verschiedener Expressionsniveaus detektiert, und alle transkribierten Bereiche des Genoms kartographiert werden. Die zu erwartenden Forschungsresultate sollen unsere Erkenntnisse aus laufenden Untersuchungen am Bundesinstitut für Risikobewertung zu Stoffwechseleigenschaften der Brucella spp. ergänzen und vertiefen helfen. Die besondere Bedeutung für die Zoonoseforschung ergibt sich aus dem Wissenszuwachs auf dem Gebiet der Regulationsnetzwerke der Bakterien im Verlauf des Wirtswechsels insbesondere auch unter Berücksichtigung der indirekten Übertragung durch das Lebensmittel. Denn jeder Zoonoseerreger passt sich bei gleichbleibender genetischer Ausstattung an den neuen Wirt oder auch an wechselnde Umweltbedingungen an. Zur Probengewinnung wurden B. microti (CCM 4915) und B. suis 1330 (ATCC) in zwei unterschiedlichen Nährmedien bei jeweils zwei verschiedenen pH-Werten kultiviert. Die zwei Teilprojekte unterscheiden sich durch die experimentellen Stress-Bedingungen: Gerhardt's Minimalmedium (GMM; pH 4.5 und pH 7.0), als Modell der intrazellulären Bedingungen in der Früh- (sauer) und Spätphase (neutral) der Infektion („Brucella-Vakuole“), und verdünntes und damit relativ nährstoffarmes Kartoffelextraktpepton-Medium (KPM; pH 5.5 und pH 7.0) als Modell für Lebensbedingungen in Böden und in Käseprodukten. Beide Teilprojekte zeichneten sich durch ein technisch identisches Arbeitsprogramm aus. Kulturen von B. suis 1300 und B. microti wurden in TS-Medium über Nacht unter Schütteln gezüchtet, und dann in GMM bzw. KPM gewaschen und aufgenommen. Je Spezies und pH-Wert wurden anschliessend drei Kulturen von je 10 ml in GMM bzw. KPM angelegt und 4 Std. bei 37°C geschüttelt. Die Kulturen wurden mit einer Ethanol-Phenol (9:1)-Mischung sofort gestoppt und die RNAs durch diese Methode 'eingefroren'. Das darauffolgend angewandte Protokoll der Gesamt-RNA-Extraktion verknüpft eine Phenol-Chloroform-Extraktion mit Affinitätschromatographie (MirVana, Ambion). Die gewonnene RNA wurde anschließend in allen Ansätzen separat mittels Nanodrop und einer Agilent-Analyse auf Quantität und Qualität überprüft. Die einwandfreie Qualität aller Proben konnte in allen Fällen nachgewiesen werden, und die jeweils 3 Proben derselben Spezies und identischer experimentellen Bedingungen wurden infolgedessen vereint. Die acht RNA-Präparationen (B. suis und B. microti in GMM bei pH 4.5 und 7 bzw. in KPM bei pH 5.5 und 7) konnten dann der in Deutschland ansässigen und auf RNA-Seq-Technologie spezialisierten Firma GATC zur weiteren Bearbeitung zugesandt werden. Die folgenden Arbeitsschritte des RNA Seq sind von GATC durchgeführt worden. Vor der Retrotranskription in cDNA sollte die rRNA aus den Proben mit der Gesamt-RNA entfernt werden, um die relative Konzentration an mRNA zu erhöhen und infolgedessen unter den gegebenen Bedingungen eine verbesserte Sequenzierungstiefe zu erreichen. Zu diesem Zwecke wurde eine 5'-Phosphat-abhängige Exonuklease-Behandlung durchgeführt, welche spezifisch rRNA-Moleküle aufgrund der Anwesenheit von 5'-Monophosphatgruppen eliminiert. Primäre mRNA-Transkripte sind aufgrund ihrer 5-Triphosphatgruppen geschützt. Die Retrotranskription (cDNA-Synthese) wurde mit 'random'-Primern durchgeführt, gefolgt von der Ligation geeigneter Adapter und der Amplifizierung mittels PCR. Die angewandten Protokolle entsprechen denen des 'TruSeq RNA sample preparation guide' von Illumina. Die Massensequenzierung der so präparierten RNA-Proben wurde nach der Illumina/Solexa- Methode ausgeführt, mit potentiell bis zu 50 000 000 möglichen 'single reads' je Probe. Diese Sequenzen wurden anschließend auf den Referenztranskriptomen (Quelle: RefSeq NCBI), d. h. den aus den Referenzgenomen abgeleiteten und annotierten offenen Leserastern, lokalisiert (mapping) und quantifiziert. Danach ergibt sich die Zahl von je ca. 1 500 000 Unikat-Sequenzen für die vier B. suis-Proben aus GMM und KPM. Die Anzahl der 'single reads' in zwei der vier B. microti-Proben liegt leider wesentlich niedriger: in den GMM-Proben bei ca. 350 000 für pH 4.5 bzw. 2 600 000 für pH 7, und in den KPM-Proben bei 1 900 000 für pH 5.5 bzw. 800 000 für pH 7. Da die kritische Probe mit nur 350 000 'single reads' dennoch statistisch gesehen eine ca. 2-3-fache Deckung des Genoms bedeutet (3300 Gene), haben wir bei der Auswertung diese Daten mit eingeschlossen. Eine von uns durchgeführte unabhängige Sequenzanalyse hat ausserdem nachgewiesen, dass ca. 95% der (multiplen) 'reads' in allen Proben rRNAs entsprechen. GATC hat uns jedoch zugesagt, mit Hilfe neuer RNA-Proben das GMM-Experiment in Kürze unter technisch verbesserten Bedingungen zu wiederholen, einschliesslich verbesserter rRNA-Depletion, und somit eine grössere, statistisch noch besser abgesicherte Datenfülle zu erhalten. Die Lokalisierung der 50-Bp-Sequenzen auf den jeweiligen Genomen und ihre Quantifizierung hat zu der Aufstellung einer Gesamttabelle geführt, bei der für jede Spezies die normalisierte Anzahl der Sequenzen (RPKM-Werte: 'reads per kilobase per million reads') je Gen und Versuchsbedingung ermittelt wurde. Es folgte die Datenanalyse durch Lokalisierung (mapping) der erhaltenen Sequenzen auf den Referenzgenomen, Transkriptrekonstruktion und Quantifizierung der Expressionsrate, sowie die statistische Auswertung. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der bekannten Genom-Informationen annotiert (Quelle: RefSeq NCBI). Um die Datenfülle des GMM-Experimentes derzeit auf ein sinnvolles, auswertbares Mass zu beschränken, wurden folgende Kriterien für die biologische Auswertung definiert: (1) annotierte Gene mit identifizierter Funktion; (2) RPKM-Werte der Gene unter beiden Bedingungen (saurer und neutraler pH) grösser als Null; (3) der Quotient pH 4.5/pH 7 muss grösser/gleich 4 oder kleiner/gleich 0,25 sein (bzw. das log10-Ratio grösser/gleich 2 oder kleiner/gleich -2). 211 Gene von B. suis erfüllen diese Bedingungen, sowie 175 Gene von B. microti. Die Analyse des KPM-Experimentes ergab dagegen eine wesentlich geringere Anzahl an differentiell regulierten Genen und es wurde nur das oben aufgeführte Kriterium (3) angewandt, allerdings für einen Quotienten pH 5.5/pH 7 grösser/gleich 2,8 oder kleiner/gleich 0,35 (bzw. das log10-Ratio grösser/gleich 1,5 oder kleiner/gleich -1,5). 38 Gene von B. suis und 72 Gene von B. microti wurden so identifiziert.

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