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Entwicklung und Validierung von Methoden zum Nachweis von Allergenen in Lebensmitteln

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-LMS-08-1322-462
Laufzeit: 01.01.2011 - 31.12.2013
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Gemäß RL 2003/13/EG, Anhang IIIa, besteht europaweit eine Kennzeichnungspflicht für vierzehn Hauptallergene in Lebensmitteln. Auf Grundlage einer Stellungnahme der zentralen Europäischen Lebensmittelbehörde (European Food Safety Authority, EFSA) (Request N° EFSA-Q-2005-084, 2006) wurden im Jahr 2007 zusätzlich neben Lupine auch Weichtiere in den Anhang IIIa aufgenommen (2007/68/EG). Hinsichtlich der Verfügbarkeit von geeigneten Nachweismethoden bestehen bis heute jedoch eklatante Lücken. Die Entwicklung und Validierung geeigneter Nachweismethoden stellt somit einen wichtigen Beitrag für die Lebensmittelsicherheit und den Verbraucherschutz dar. Neben dem immunologischen Nachweis mit Hilfe von Antikörpern wird zurzeit die DNA-basierende Polymerasekettenreaktion (PCR) als indirektes Screening-Verfahren eingesetzt. Methoden, welche auf kommerziellen Antikörpern beruhen, werden jedoch in der Europäischen Normierung nur mit Vorbehalt akzeptiert, da eine Abhängigkeit von Antikörperherstellern besteht. Als direktes Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Allergenen eignen sich insbesondere 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrische Methoden (De Angelis et al. 2010, Sancho et al. 2010, MoniQA-Studie). Die Entwicklung auf diesem Gebiet steht jedoch noch in den Anfängen. Standardmethoden zur massenspektrometrischen Allergendetektion existieren noch nicht. Aufgrund der besonderen gesundheitsrelevanten Bedeutung soll die Entwicklung und Validierung von routinegeeigneten Methoden zum Allergennachweis auf Proteinebene vorangetrieben werden. Schalentiere und Weichtiere gehören in Europa, neben Milch, Ei und Baumnüssen, zu den häufigsten allergieauslösenden Nahrungsmitteln bei Erwachsenen. Mollusken und Krebstiere zählen zu den artenreichsten Tiergruppen, die als Lebensmittel oder Zutat in Lebensmitteln Verwendung finden. Sie werden auch häufig unter dem Begriff „Meeresfrüchte“ (engl. Shellfish) zusammengefasst. Überempfindlichkeit gegen Mollusken sowie Kreuzreaktionen mit Krebstieren (Crustacea) ist ein bekanntes Phänomen, welches sich nicht nur auf Länder mit einem traditionell hohen Konsum derartiger Lebensmittel beschränkt. Die Europäische Gesetzgebung listet daher Krebstiere und Produkte aus Krebstieren sowie Mollusken und deren Produkte im Anhang IIIa der Richtlinie 2003/13/EG, die die Kennzeichnung von Allergenen fordert, auf. Alle potentiell allergenen Zutaten in diesem Anhang müssen – unabhängig von ihrer Menge - gekennzeichnet werden, sobald sie in einem Lebensmittel präsent sind. Der außergewöhnlichen Vielfalt von Mollusken und Krebstieren in der menschlichen Ernährung stehen derzeit jedoch nur wenige Detektionsverfahren gegenüber. Die Analytik basiert vor allem auf kommerziellen, immunologischen Testkits, welche jedoch nur ein beschränktes Artenspektrum abdecken. Bis heute existieren noch keine offiziellen, in einem Ringversuch validierte Methoden zur Detektion von Mollusken und Krebstieren, die im Rahmen der Eigenkontrolle als auch der offiziellen Lebensmittelkontrolle eingesetzt werden, um die Sicherheit von Lebensmitteln zu garantieren. Es gibt z. Zt. noch keine PCR-Verfahren für den Nachweis von Schalen- bzw. Weichtieren und nur vereinzelte immunologische Kits kommerzieller Anbieter. Zusätzlich zu der massenspektrometrischen Nachweismethode ist die Entwicklung von auf PCR basierenden Übersichtsmethoden ein weiteres Ziel des Projektes. Diese sollen geeignet sein, die ökonomisch relevantesten Krebstier- und Molluskenarten in einem Analysegang im Lebensmittel zu detektieren. Dies wird dadurch erreicht, dass verschiedene spezifische PCR-Systeme parallel auf einer Mikrotiterplatte gebrauchsfertig vorpipettiert werden („ready-to-use“). Der methodische Ansatz kann in jedem Labor unabhängig von kommerziellen Anbietern durchgeführt werden und stellt einen wesentlichen Beitrag dar, die derzeitige Lücke in der Lebensmittelüberwachung zu schließen. Es gibt zur Zeit noch keine validierten PCR-Verfahren für den Nachweis von Schalen- bzw. Weichtieren in Lebensmitteln und nur vereinzelte immunologische Kits kommerzieller Anbieter. Im Berichtsjahr 2012 konnten eine Reihe von PCR Methoden für den Nachweis von Schalen- und Weichtieren entwickelt werden, jedoch ist besonders die Extraktion von RNA aus Molluskenproben problematisch. Das Hauptziel des Projektes bestand demnach in der Auffindung von hitzestabilen Molluskenproteinen, die für eine Detektion von Molluskenmaterial mittels LC-Massenspektrometrie in kontaminierten Lebensmitteln genutzt werden können sowie in der Etablierung der notwendigen LC-MS Methoden. Das 2-DE basierte Screening von Proteinextrakten aus verschiedenen Molluskenarten hat ergeben, dass potentiell eine Reihe von hochabundanten hitzestabilen Proteinen für einen massenspektrometrischen Nachweis von Molluskenmaterial in Lebensmitteln zur Verfügung stehen. Nach der endgültigen Auswahl einer Batterie von Markerproteinen nach Vorliegen und Auswertung der kompletten Ergebnisse kann mit der Etablierung von SRM Protokollen für den sensitiven Nachweis der gewählten Proteine in Lebensmittelmatrices begonnen werden.

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