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Unterscheidung von konventionell und ökologisch erzeugten Regenbogenforellen

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-MF-08-152-1050 Regenbogenforelle
Laufzeit: 01.08.2016 - 31.10.2018
Forschungszweck: Bestandsaufnahme & Abschätzung

Die Expression von Genen ist nicht nur von regulatorischen DNA Sequenzen abhängig, auch die Konfiguration des Chromatins und der Status der DNA Methylierung der flankierenden Regionen der entsprechenden Gene sind entscheidend. Die meisten DNA Methylierungen in mehrzelligen Eukaryoten finden sich an der 5‘ Position des Cytosins, im Übergang zum Guanin („CpG sites“). Eine epigenetische Modifikation kann als eine vererbbare, mitotische oder meiotische Veränderung der Funktion des Genes, ohne dessen Sequenz zu verändern, angesehen werden. Gene deren Expression auf einem Allel unterdrückt werden sollen, werden durch einen als Prägung („imprinting“) genannten Prozess während der embryonalen Entwicklung methyliert. Diese genomische Prägung („genomic imprinting“) ist intensiv im Genom von Säugetieren wie Mäusen oder Menschen untersucht worden. Es gibt allerdings nur wenig Informationen über genomic imprinting in oviparen Spezies, wie z.B. Fisch. Diese Untersuchungen beziehen sich fast ausschließlich auf das Modelltier Zebrafisch (Danio rerio). Die festgestellten Reprogrammierungen der DNA des Zebrafisches sind ähnlich der nachgewiesenen Modifikationen während der Entwicklung der Säugetiere. Der Großteil der CpG Inseln ist in den Promotoren, den ersten beiden Exonen und dem dazwischen liegenden ersten Intron lokalisiert. Dieses macht noch einmal die Bedeutung dieser DNA Modifikation deutlich. Das Cytosin wird an der C5 Position des Pyrimidinringes durch die katalytische Wirkung der DNA-Metyltransferasen methyliert, der Methyldonor ist S-Adenosylmethionin (SAM). Obwohl der exakte Mechanismus der Demethylierung der CpG Inseln noch nicht vollständig verstanden ist, zeigt eine CpG Demethylierung sowohl bei extragener, wie auch intragener Lokalisation eine erhöhte Transkriptionsrate. Es ist inzwischen allgemein akzeptiert, dass DNA Hypermethylierung und Promotoraktivität eng korreliert sind, obwohl auch diskutiert wird, dass genferne Methylierungen transkriptionsregulierende Eigenschaften aufweisen. Kürzlich ist eine Publikaton zu DNA Methylierungsunterschieden zwischen residenten und wandernden Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) erschienen. In dieser Publikation werden 57 Bereiche differentiell regulierter Methylierungsregionen (DMRs) identifiziert. Von 57 DMRs waren 26 genassoziiert, die in zwei Gennetzwerke zusammengefasst werden können. Die Gene des einen Netzwerkes sind im Wesentlichen an der zellulären Organisation und der Entwicklung des Nervensystems, die Genen des anderen Netzwerkes vor allem an der Organisation der Organmorphologie und der Entwicklung der Organe beteiligt. Dabei sind sowohl Hyper- wie auch Hypomethylierungen nachgewiesen worden. Es sollen jeweils 20 Marktproben von konventionell und ökologisch gefarmten Regenbogenforellen erworben werden. Nach DNA Extraktion werden zunächst die Promotoren der Gene für die Proteine Trout C-polysaccharide binding protein 1- isoform 1, Complement C1q tumor necrosis factor-related protein 3, Caspase-14, GTPase IMAP family member 5, Complement C1q-like protein 2 und R7TU90, ein bisher uncharakterisiertes Protein, amplifiziert und sequenziert. Diese Gene haben sich in der Studie von Christie et al. 2016 als deutlich differentiell exprimiert erwiesen. Im weiteren Verlauf des Projektes werden die methylierten Cytosine der DNA durch Bisulfitbehandlung in Uracil umgewandelt und die entsprechenden Regionen nach Amplifikation sequenziert. Durch Vergleich mit den Ursprungssequenzen ist die Erstellung einer basengenauen Methylierungskarte möglich. Parallel soll versucht werden, die Expressionsrate der entsprechenden mRNAs zu bestimmen. Diese ist wegen der möglichen Degradation der mRNA jedoch nicht unbedingt durchführbar. Neben den oben skizzierten Experimenten soll ferner versucht werden, mit anti-5-Methylcytosin Antikörpern eine Anreicherung der methylierten DNA zu erreichen und immunchemische Verfahren (Histochemie, Immunoblotting) zu entwickeln, um den Nachweis zu beschleunigen bzw. zu vereinfachen.

Ökologisch und konventionell gehaltenen Forellen wurde bei den entsprechenden Betrieben käuflich erworben und DNA und RNA aus der Muskulatur isoliert. Die RNA wurde mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Nach real time PCR zur Analyse von 26 Transkripten zeigte sich, dass drei Gene (Carnitin-Palmitoyltransferase I (CPT I), Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor beta (PPARbeta) und Elongationsfktor 1 (EF1)) im ökologisch gehaltenen Forellen signifikant (p kleiner als 0,05) höher in Muskulatur exprimiert werden. Die Expression des Genes Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor alpha (PPARalpha) war tendenziell in konventionell gehaltenen Forellen höher (p kleiner als 0,07), während das Gen für Das Hitzeschock 70kDa Protein 12A (HS12A) in konventionell gehaltenen Forellen tendenziell (p kleiner als 0,1) niedriger exprimiert wurde. Es wurde insgesamt 13 Promotor und regulatorische Bereich der entsprechenden Gene im Hinblick auf Methylierungsunterschiede analysiert. Dazu wurden die DNA jeweils einer Bisulphitbehandlung unterzogen und die interessierenden Bereiche mit speziellen Primern amplifiziert. Die Fragmente wurden kloniert und sequenziert. In den Genen für PPARalpha konnte an einer Position im ersten Intron ein Methylierungsunterschied festgestellt werden. Die Forellen aus ökologischer Haltung zeigten einen Methylierung, die aus konventioneller Haltung nicht. Bei Gene für CPT I war konnte im Promotorbereich an eine Position eine Methylierung bei den konventionell gehaltenen Forellen gezeigt werden, während bei Forellen aus ökologischer Haltung keine Mehylierung nachgewiesen werden konnte. Ob diese Methylierungen für die Expressionsunterschieden ursächlich verantwortlich sind, und ob die Muster der Methylierung sich allgemein auf konventionell bzw. ökologisch gehaltene Forellen übertragen lassen werden weiter Untersuchungen zeigen.

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