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Nano-Imaging Methoden zur Visualisierung von Nanopartikeln in vitro und in vivo: Untersuchungen zur Aufnahme, zur Verteilung und quantitative Bestimmung

Projekt


Förderkennzeichen: BfR-CPS-08-1322-502
Laufzeit: 01.05.2012 - 31.12.2016
Forschungszweck: Grundlagenforschung

Die stetig anwachsende Zahl kommerzieller Produkte mit Nanopartikeln führt zu der Notwendigkeit, die möglichen adversen Effekte auf den Menschen genauer zu untersuchen. Durch eine Verringerung der Partikelgröße in den nanoskaligen Bereich verändern sich die physikochemischen Eigenschaften in mitunter unvorhergesehener Weise. Dies kann auch ein verändertes Verhalten (z.B. zelluäre Aufnahme, Transport, Akkumulation und Verteilung sowie Ausscheidung) bedingen und erschwert die Risikobewertung, da sich das Verhalten der Nanopartikel nicht aus dem Verhalten des Bulkmaterials ableiten lässt. Hinzukommt, dass es im Zusammenhang mit der Testung von Nanopartikeln noch großen Bedarf bei der Methodenentwicklung und -anpassung gibt. Dies ist der Anknüfungspunkt für dieses Sonderforschungsprojekt, dessen Zielstellung dreigeteilt ist. Eine der großen Herausforderungen ist die Bestimmung der internen Dosis, da robuste Methoden zur Detektion und Quantifizierung von Nanopartikeln in biologischer Umgebung fehlen. Hier sollen verschiedene Methoden zur Detektion und Quantifizierung von NP in Zellen getestet und etabliert werden, wobei der Fokus auf Verfahren liegt, die in biologischen Laboren zu den etablierten Standardtechniken gehören wie z.B. Durchflusszytometrie und Konfokallaser-Mikroskopie. Parallel zu diesem Sonderforschungsprojekt werden in zwei Vergabe an Dritte an Projekten, von denen eines 2015 endete, spezielle Techniken wie Elektronenmikroskopie, Röntgenmikroskopie oder verschiedene ICP-MS basierte Methoden eingesetzt um diese genaueren aber sehr viel aufwendigeren Methoden schlussendlich mit den Daten der fluoreszenzbasierten Verfahren zu vergleichen. Im zweiten Teil des Projektes geht es darum, dass Nanopartikel in biologischer Umgebung sehr schnell mit Proteinen interagieren und eine sogenannte Proteincorona ausbilden, wobei diese Proteincorona in in vitro Studien die zelluläre Aufnahme und Verteilung der Partikel maßgeblich beeinflusst. Demnach lässt sich ein Projekt, welches die Aufnahme von Nanopartikeln in Zellen untersucht nicht lösgelöst von der Frage betrachten, welche Rolle die Proteincorona dabei spielt. Allerdings gibt es bisher kaum systematische Studien, inwieweit bestimmte Proteine der Corona mechanistisch die Aufnahme beeinflussen. Der letzte Part dieses Projektes entwickelt ein Tool, mit welchem sich intrazelluläre Prozesse nach der NP Aufnahme detaillierter betrachten lassen. Es sollen hier Nanopartikel hergestellt werden, welche über ein in biologischer Umgebung abspaltbares Coating verfügen. In der Folge wäre annehmbar, dass damit die Nanopartikel destabilisiert sind, vermutlich solubilisieren oder agglomerieren und somit nicht mehr als Nanopartikel vorliegen. Mit diesem Ansatz sollten sich partikuläre Wirkungen von nicht-partikulären unterscheiden lassen.

2017: Die stetig anwachsende Zahl kommerzieller Produkte mit Nanomaterialien führt zu der Notwendigkeit, die möglichen adversen Effekte auf den Menschen genauer zu untersuchen. Nanomaterialien können im Vergleich zu herkömmlichen Materialien ein anderes Verhalten aufweisen also z.B. in Bezug auf zelluläre Aufnahme, Transport, Akkumulation oder Verteilung. Das Verhalten der Nanomaterialien lässt sich nicht aus dem Verhalten ähnlicher herkömmlicher Materialien vorhersagen und muss daher experimentell im Einzelfall untersucht werden. Allerdings müssen Messmethoden dazu noch angepasst oder entwickelt werden, was der Ansatzpunkt dieses SFP ist. Eine der großen Herausforderungen ist die Bestimmung der internen Dosis, da bisher robuste Methoden zur Detektion und Quantifizierung von Nanopartikeln in biologischer Umgebung noch fehlen. Dieser SFP wird daher verschiedene mögliche Methoden zur Nanopartikel Detektion und Quantifizierung in Zellen testen und vergleichen. Dazu gehören z.B. die Durchflusszytometrie und Konfokallaser-Mikroskopie und über entsprechende Kooperationen auch die Elektronenmikroskopie, die Röntgenmikroskopie oder verschiedene ICP-MS basierte Methoden. Im zweiten Teil des Projektes geht es darum, dass Nanopartikel in biologischer Umgebung sehr schnell mit Proteinen interagieren und eine sogenannte Proteincorona ausbilden. Diese Proteincorona beeinflusst die zelluläre Aufnahme und Verteilung der Partikel in vitro maßgeblich. Dieses Projekt soll daher mit verschiedenen Methoden den Einfluss der Proteincorona bei der zellulären Aufnahme von Nanomaterialien untersuchen. Im letztem Teil geht es darum, was mit den Nanopartikeln nach zellulärer Aufnahme passiert und um deren Stabilität in biologischer Umgebung. Hierzu sollen Nanopartikeln mit spezifischen Coatings entwickelt werden. Die Coatings sollen entweder besonders stabil sein oder aber gezielt in biologischer Umgebung abspaltbar. Zusammenfassend soll dieser SFP diverse Methoden testen, entwickeln und vergleichen, mit denen sich die Nanopartikelaufnahme untersuchen und quantifizieren lässt. Diese Techniken sollen dann zum Einsatz kommen, um die Rolle der Proteincorona bei der zellulären Aufnahme sowie die Stabilität der Nanopartikel in biologischer Umgebung zu untersuchen.

In diesem Projekt konnten erfolgreich verschiedene Methoden getestet werden, um die Nanopartikel Aufnahme zu untersuchen. Jede einzelne Methode bietet bestimmte Vorteile und hat jedoch auch Limitierungen. So konnten die Durchflusszytometrie und die Konfokalmikroskopie erfolgreich eingesetzt werden, um die zelluläre Aufnahme von fluoreszenzmarkierten SiO2 Nanopartikeln zu untersuchen. Dabei besteht allerdings die Gefahr, dass durch kovalente Anbindung eines Farbstoffs auf der Nanopartikel-Oberfläche diese verändert werden und der Farbstoff kann zudem auch im Zeitverlauf abgespalten und freigesetzt werden, was die Ergebnisse verfälschen kann. Um dies zu verhindern, wurden hier spezielle Core-Shell Nanopartikel hergestellt, welche eine Fluoreszenzmarkierung aufwiesen, die dann aber nochmals mit einer Silica-Schicht ummantelt war. Auf diese Weise konnten beide oben genannten Techniken erfolgreich eingesetzt werden, um die zelluläre Aufnahme von drei verschieden großen SiO2 Nanopartikeln zu untersuchen. Es zeigten sich größenspezifische Unterschiede, d.h. die kleineren 15 nm großen Partikel wurden schneller und effizienter in verschiedene Zellmodelle aufgenommen. Auch die zellulären Aufnahmemechanismen waren abhängig von der Nanopartikelgröße, aber auch vom verwendeten Zellmodell. Die Vorteile dieser fluoreszenz-basierten Methoden sind, dass diese Techniken in biologischen Laboren weit verbreitet sind, keine aufwändige Probenpräparation erfordern und zudem Informationen auf Einzelzell-Niveau liefern. Ein Nachteil ist, dass damit eine genaue Quantifizierung nicht möglich ist, da die Labelling-Effizienz der einzelnen Partikel nicht so einfach bestimmbar ist und zudem auch innerhalb von verschiedenen Partikeln in einem Batch schwanken kann. Außerdem konnten erfolgreich drei verschiedene ICP-MS basierte Methoden eingesetzt werden um die zelluläre Aufnahme von zwei verschieden großen Silber- und zwei verschieden großen TiO2 Partikeln zu untersuchen. Die konventionelle ICP-MS erlaubte die zuverlässige Bestimmung der Gesamtgehalte und unter Berücksichtigung der Zellanzahl ließ sich so eine mittlere Dosis pro Zelle berechnen. Mittels Single Particle ICP-MS konnten wir einerseits die Daten der konventionellen ICP-MS bestätigen und zudem die Partikelgrößen im biologischen Material untersuchen. Mit Laser-Ablations ICP-MS gelang die Untersuchung auf Einzelzell-Niveau, wobei sich die zelluläre Aufnahme verschiedener Zellen in der gleichen Kultur sehr unterschied. Auch hier zeigten sich größenspezifische Unterschiede in der Aufnahme sowohl für Silber als auch für TiO2. Vergleicht man die aufgenommenen Mengen auf Basis der Nanopartikel- Massen so werden die größeren Partikel effizienter aufgenommen. Vergleicht man hingegen die Nanopartikelanzahl so werden die kleineren Partikel effizienter aufgenommen. ICP-MS basierte Techniken sind zusammenfassend sehr gut geeignet für die Untersuchung der Nanopartikel-Aufnahme von Metall.-basierten Nanopartikeln und erlauben in Varianten auch Angaben über die Partikelgröße bzw. erlauben Aussagen über einzelne Zellen. Ebenso konnte erfolgreich eine relativ neue Methode, Focused Ion Beam in Kombination mit Rasterelektronenmikrospie (FIB-SEM) eingesetzt werden, um die genaue Anzahl an Silberpartikeln in einer Zelle zu ermitteln. Dazu wurde ein mathematischer Algorithmus entwickelt, der die automatisierte Auswertung ermöglicht. Das Ergebnis wurde verifiziert über Transmissionselektronenmikroskopie und ICP-MS. Zudem konnte der Einfluss der Proteincorona bei der Nanopartikelaufnahme mittels Durchflusszytometrie und Konfokalmikroskopie untersucht werden. Dabei wurde nicht nur, wie bereits von anderen ebenfalls festgestellt, eine unterschiedliche Aufnahme in An- bzw. Abwesenheit einer Proteincorona festgestellt, sondern es gelang auch einzelne Proteine in der Proteincorona zu identifizieren, welche vermutlich an der Aufnahme der Partikel beteiligt sind. Zusammenfassend wurden die Ziele dieses SFP in vollem Umfang erfüllt.

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