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Entwicklung und Validierung molekularer toxikologischer Prüfmethoden zur Chemikaliensicherheit: Aufbau und Etablierung von neuen in vitro und nicht-vertebraten Testverfahren

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-TOX-08-9-003
Laufzeit: 01.01.2015 - 31.12.2019
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Die zunehmende Besorgnis über die Gefährdung der Gesundheit durch endokrin-wirksame Chemikalien, Biozide oder Pflanzenschutzmittel (Endokrine Disruptoren, ED) hat unter anderem dazu geführt, dass verschiedene Europäische Verordnungen potenzielle ED besonders streng regulieren. Aus diesem Grund besteht derzeit ein großer Bedarf an prädiktiven Testmethoden zur ED Identifizierung und Bewertung. Ein Schwerpunkt der experimentellen Arbeiten in der Fachgruppe 94 liegt deshalb in der Entwicklung tierversuchsfreier Testmethoden im Sinne des 3R-Prinzips mit besonderem Fokus auf ED. Unsere experimentellen Arbeiten fußen dabei auf zwei wesentlichen Standbeinen, der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie (BioImaging Unit) sowie dem Roboter-gestützten high content/high throughput (HC/HT) Screening (Screening Unit). Mit Hilfe der BioImaging Unit erarbeiten wir uns zunächst ein grundlegendes Verständnis molekularer Wirkmechanismen von ED auf zellulärer Ebene und identifizieren mögliche zellbiologisch-relevante Endpunkte als Grundlage für die Entwicklung tierversuchsfreier Testmethoden. Mit Hilfe der Screening Unit optimieren wir anschließend die entwickelten Testmethoden hinsichtlich ihrer Hochdurchsatzfähigkeit und Automatisierbarkeit, und validieren abschließend deren Verlässlichkeit und Relevanz in Bezug auf bereits existierende tierversuchs-basierte Testmethoden. Derzeit befinden sich zwei Testmethoden, der MCF-7 Assay und der C. elegans Assay, im Übergang von der Entwicklungs- zur Automatisierungsphase. Der MCF-7 Assay basiert auf quantifizierbaren Veränderungen der Zellmorphologie einer humanen Brustkrebszelllinie, die mit der Aktivität des Östrogen-Rezeptor Signalweges einhergehen. Unsere derzeitigen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass sich diese Korrelation auch in Gewebeschnitten von Patientinnen mit metastasierendem Brustkrebskarzinom darstellen lässt. Aus diesem Grund nutzen wir die östrogen-abhängige Veränderung der Zellmorphologie von MCF-7 Zellen als zellbiologisch-relevanten Endpunkt zur Identifikation und Charakterisierung von ED, die den Östrogen-Rezeptor Signalweg nachhaltig beeinflussen und sich somit möglicherweise auf die Brustkrebsprogression auswirken können. Der C. elegans Assay basiert auf der Beeinflussung des Wachstums und der Reproduktionsfähigkeit des invertebraten Modelorganismus C.elegans durch endokrin-aktive Stoffe. Die bisherigen Erkenntnisse zu einer Gruppe von Pestizidwirkstoffen, den Azolfungiziden, legen eine gute Vergleichbarkeit des Assays mit Versuchen in männlichen Ratten sowie in zellbasierten Testsystemen nahe. Der C. elegans Assay vereint Vorteile gängiger in vivo und in vitro Testsysteme und ermöglicht zudem die effiziente Identifikation und Charakterisierung der Kombinationswirkung von ED im Rahmen von Entwicklungstoxizitätsstudien anhand zellbiologisch-relevanter Endpunkte. Im Haushaltsjahr 2018 verfolgen wir das Ziel, beide Assays mit Hilfe der Screening Unit für Roboter-gestütztes HC/HT Screening weiter zu optimieren und standardisierte Abläufe zu automatisieren. Die Automatisierungsphase beinhaltet sowohl die Etablierung von Färbeprotokollen als auch die Erstellung effizienter Pipelines zur Bildanalyse mit Hilfe integrierter Software und zur automatischen Verarbeitung gewonnener Messdaten durch open source Analyseplattformen, wie KNIME. Im Rahmen der Automatisierungsphase werden wir gegen Ende des Haushaltsjahres 2018 vermutlich auch damit beginnen können, die genannten Assays unter Verwendung einer aus derzeit 444 potenziell endokrin-aktiven Umweltchemikalien bestehenden Chemikalienbibliothek hinsichtlich ihrer Verlässlichkeit und Relevanz zu validieren. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Wirkung dieser Stoffe, einzeln als auch in Kombination, auf zelluläre Modellsysteme bis hin zu einem kompletten Organismus, wie C.elegans, sollen dann wiederum in unsere Untersuchungen zugrundeliegender molekularer Wirkmechanismen von ED einfließen. Einen wesentlichen Aspekt des Haushaltsjahres 2018 und darüber hinaus stellt der weitere Ausbau der benötigten IT-Infrastruktur als auch die Identifizierung und Etablierung geeigneter Möglichkeiten zur effizienten und nachvollziehbaren Organisation der durch die BioImaging und Screening Units generierten Daten dar. Zudem ist die für das vergangene Haushaltsjahr avisierte Fertigstellung des Geräteraumes sowie die Installation der Mikroskope noch nicht vollständig umgesetzt, sodass die Einarbeitung in die Funktionsweise der neuen Geräte und Software und deren fachgruppenübergreifende Integration in laufende Forschungsprojekte auch einen Schwerpunkt dieses Haushaltsjahres darstellt. Unser primärer Fokus auf bildgebende Verfahren im Rahmen der Entwicklung tierversuchsfreier Testmethoden wird zudem durch eine Reihe von molekularbiologischen Analysen auf Genom-, Transkriptom-, und Proteom-Ebene zur Identifizierung relevanter molekularer Wirkmechanismen komplementiert.

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