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Impressum
Molekularbiologie pisciner Herpesviren
Projekt
Förderkennzeichen: FLI-IMVZ-08-DA_0002
Laufzeit: 01.01.2001
- 31.12.2020
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Durch Herpesviren verursachte Krankheiten können bei Fischen zu erheblichen wirtschaftlichen Verluste führen. Das in den letzten Jahren des 20. Jahrhunderts erstmals beschriebene Koi-Herpesvirus tritt mittlerweile fast weltweit auf und verursacht nicht nur bei Kois, sondern auch bei Nutzkarpfen schwere Erkrankungen mit hohen Mortalitätsraten. Die DNA-Sequenz des Virusgenoms ist inzwischen vollständig bekannt, jedoch wurden bislang nur wenige virale Genprodukte identifiziert und strukturell oder funktionell analysiert. Leider sind auch Analogieschlüsse zu den deutlich besser charakterisierten Herpesviren der Säugetiere und Vögel nur in sehr begrenztem Umfang möglich, da aufgrund des großen phylogenetischen Abstandes fast keine Sequenzhomologien zu beobachten sind. Andererseits gibt es weitere wenig untersuchte, aber wirtschaftlich ebenfalls relevante pathogene Herpesviren bei Karpfen, Aalen und Salmoniden, deren Genome deutliche Ähnlichkeiten zu dem von KHV zeigen. Somit könnten bei der molekularbiologischen Charakterisierung des KHV gewonnene Erkenntnisse auch bei der Bekämpfung anderer Fischseuchen hilfreich sein. Vorrangige Ziele unserer derzeitigen Arbeiten sind die Identifizierung immunrelevanter Hüllproteine des KHV, die in heterologen Systemen exprimiert als diagnostische Antigene, Vektor-, oder DNA-Vakzinen geeignet sein könnten, sowie die gezielte Deletion nicht essentieller Gene aus dem KHV Genom zur Generierung attenuierter Lebendvirus-Impfstoffe. Außerdem soll durch die Herstellung von KHV Deletionsmutanten und trans-komplementierenden Zelllinien versucht werden, die Funktionen einzelner v.a. membranassozierter Viruproteine bei Rezeptorbindung und Viruseintritt, primärer und sekundärer Umhüllung, sowie der Freisetzung reifer Viruspartikel aufzuklären.
Bislang wurden neun potentielle Membranproteine des KHV untersucht, von denen wir sechs (pORF25, pORF65, pORF81, pORF99, pORF136 und pORF149) wie auch das Haupkapsidprotein (pORF92) mittels der hergestellten monospezifischen Antiseren in infizierten Zellen nachweisen konnten. Da die in eukaryoten Zellen transient exprimierten Genprodukte pORF25, pORF65 und pORF149 in Immunfluoreszenztests auch mit Serumantikörpern aus experimentell und natürlich infizierten Karpfen reagierten, könnten diese Proteine als diagnostische Antigene geeignet sein. Darüber hinaus wurde pORF149 als Zielprotein mehrer KHV-spezifischer monoklonaler Antikörper identifiziert. Das polyklonale Antiserum gegen das abundante Virusprotein pORF81 war besonders gut zur Detektion von KHV-Virionen und infizierter Zellen in Geweben erkrankter Fische durch Western Blot, indirekte Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und Immunelektronenmikroskopie geeignet. Mittlerweile gelang es uns, KHV-Rekombinanten herzustellen, die Deletionen der Gene für die immunogenen Hüllglykoproteine pORF25, pORF65, pORF148 und/oder pORF149 aufweisen, was belegte, dass diese für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Leider zeigten die ORF148 und ORF149 Deletionsmutanten in Tierexperimenten keine signifikante Reduktion der Virulenz, sodass diese KHV-Rekombinanten als Lebendvakzinen ungeeignet sind. Allerdings könnte durch die zusätzliche Deletion echter Virulenzfaktoren möglicherweise DIVA (differentiation of infected from vaccinated animals) Vakzinen generiert werden, die eine serologische Unterscheidung geimpfter von natürlich infizierten Fischen erlauben. Da bei verschiedenen Säugerherpesviren die Gene für Enzyme des Nukleotidstoffwechsels als wichtige Virulenzfaktoren identifiziert wurden, haben wir KHV-Rekombinanten mit Deletionen der Gene für die virale Thymidinkinase (TK, pORF55), die Desoxyuridin Triphosphat-Hydrolase (DUT, pORF123), oder die große Untereinheit der Ribonukleotidreduktase (RNR, pORF141), sowie entsprechende Revertanten hergestellt. Aufgrund funkionshomologer zellulärer Proteine waren diese Deletionsmutanten in Karpfenzellkulturen vermehrungsfähig. Allerdings zeigte das RNR-negative KHV gegenüber Ausgangsvirus und Revertante deutliche Replikationsdefekte, die eine effiziente Produktion als mögliches Impfvirus erschweren dürften. Die in vitro Vermehrung der TK- und DUT-negativen KHV-Mutanten und entsprechender Doppelmutanten war dagegen nicht erkennbar beeinträchtigt. Zur weiteren Verbesserung der Vermehrbarkeit wurden die Mutationen inzwischen auch in einen Zellkultur-adaptierten KHV-Stamm (KHV-Taiwan) eingeführt, der zu fast 1000fach höheren Titern repliziert als das ursprünglich verwendete Feldisolat aus Israel. In experimentell infizierten Karpfen verursachten alle Mutanten deutlich weniger ausgeprägte Krankheitssymptome und weit geringere Mortalitätsraten als das hochpathogene Ausgangsvirus und die TK- und DUT-negative Dopplemutante erwies sich nahezu avirulent. Dennoch waren die Fische nach einmaliger Bad-Immunisierung gegen Belastungsinfektionen mit letalen KHV Dosen geschützt. . Zur Erleichterung der diagnostischen Differenzierung von mit den potentiellen KHV-Vakzinen und KHV-Wildtypviren infizierten Fische wurden PCR-Methoden etabliert, die einen raschen Nachweis der Unterschiede im TK- und dUTPase-Genlocus ermöglichen. Außerdem wurde eine beschriebene KHV-spezifische real-time PCR (qPCR), durch zusätzliche TK-genspezifische Primer und Sonden zu einer hochsensitiven Multiplex qPCR erweitert, die eine Differenzierung geimpfter und Wildtypvirus-infizierter Karpfen anhand von Kiemenabstrichen erlaubt (genetic DIVA). Inzwischen wurden auch KHV-Rekombinanten generiert, die kombinierte Deletionen der TK, DUT, ORF148 und ORF149 Gene aufweisen und nun in vitro und in vivo charakterisiert werden sollen. Veröffentlichungen Fuchs W, Granzow H, Dauber M, Fichtner D, Mettenleiter TC. 2014. Identification of structural proteins of koi herpesvirus. Arch Virol 159, 3257-3268. Fuchs W, Fichtner D, Bergmann SM, Mettenleiter TC. 2011. Generation and characterization of koi herpesvirus recombinants lacking viral enzymes of nucleotide metabolism.Arch Virol 156, 1059-1063. Rosenkranz D, Klupp BG, Teifke JP, Granzow H, Fichtner D, Mettenleiter TC, Fuchs W. 2008. Identification of envelope protein pORF81 of koi herpesvirus. J Gen Virol 89, 896-900.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Tiergesundheit
- Binnenfischerei
- Teichwirtschaft
- Biotechnologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
FLI - Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (FLI - IMVZ)
