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Verkürzung und Optimierung des Nachweises von Listerien und L. monocytogenes in Milcherzeugnissen

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: AiF 13433 N
Laufzeit: 01.01.2002 - 31.12.2005
Fördersumme: 291.400 Euro
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Die konventionelle kulturelle Untersuchung von Lebensmitteln auf Listerien wird international (ISO, IDF), supranational (CEN) und national (DIN, Amtl. Sammlung § 35 LMBG) nach dem gleichen Schema – Primäranreicherung, evtl. Unteranreicherung, Nachweis, Bestätigung - durchgeführt. Der komplette Untersuchungsgang einschließlich Bestätigung verdächtiger Kolonien dauert bis zu 12 Tagen, ein negatives Ergebnis liegt frühestens nach 5 Tagen vor. Insbesondere für Produkte mit kurzer Haltbarkeit ist diese Zeitspanne nicht akzeptabel. Da die Produkte bis zum Vorliegen eines Ergebnisses im Betrieb verbleiben müssen, können außerdem beträchtliche Kosten für die Bereitstellung von Lagerkapazitäten anfallen. Aus diesem Grund gibt es in letzter Zeit Anstrengungen zur Neuentwicklung von Methoden für den Schnellnachweis von Listerien auf der Basis von Nukleinsäure-Hybridisierung, Nukleinsäure-Amplifikation durch PCR und Immunoassays, aber auch auf der Basis alternativer Nachweisverfahren. Ziel des Forschungsvorhabens war die Entwicklung von Verfahren zum Nachweis von Listerien in Milcherzeugnissen innerhalb von ca. 24 h. Als Grundlage diente dabei zum einen die so genannte TaqMan-PCR, eine Modifikation der Polymerase-Kettenreaktion mit automatischer Online-Detektion der Amplifikationsprodukte auf Basis fluoreszierender Oligonukleotidsonden. Zum anderen wurden rekombinante listerienspezifische Bakteriophagen sowie rekombinant hergestellte zellwandbindende Domänen aus Phagenlysinen zur Separation und zur Detektion von Listerien verwendet. Forschungsergebnis: Im Rahmen des Projekts wurde eine genussspezifische TaqMan-PCR zum Nachweis von Listeria spp. und eine speziesspezifische TaqMan- PCR für den Nachweis von L. monocytogenes entwickelt. Der genusspezifische Nachweis für Listeria spp. erfasst mit L. monocytogenes, L. innocua, und L. seeligeri die wichtigsten und am häufigsten in Milchprodukten nachgewiesenen Listerienspezies. Wenn für bestimmte Anwendungen die vollständige Erfassung des Genus Listeria erforderlich ist, besteht die Möglichkeit, im gleichen Nachweissystem anstelle der fluoreszenzmarkierten TaqMan-Sonde den interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff SybrGreen zu verwenden. Der speziesspezifische Nachweis für L. monocytogenes erfasst alle getesteten Stämme dieser Spezies und reagierte mit keiner anderen Spezies falsch positiv. Bei Versuchen zur Anwendbarkeit der Nachweise für komplexe Lebensmittelmatrizes wurde keine negative Beeinflussung der PCR-Nachweise durch Probenbestandteile beobachtet. In künstlich kontaminierter Milch und verschiedenen Käse-Standardsorten konnten die Listerien nach 48 h selektiver Anreicherung korrekt nachgewiesen werden. Für eine weitere Verkürzung der Nachweiszeit wurden die Listerien nach einer Übernachtanreicherung mit den an der Forschungsstelle III entwickelten paramagnetischen listerienbindenden CBD-Partikeln isoliert und anschließend eine kurze Anreicherung (3 h) in einem nichtselektiven Medium durchgeführt. Mit dieser Methode konnte die Nachweiszeit auf 32 h reduziert werden. Allerdings ist diese Methode insbesondere bei erfahrungsgemäß kritischen Matrizes wie Rotschmierekäse etwas weniger sensitiv als die Methode mit 48 h Anreicherung. Die zellwandbindenden Domänen der Phagenlysine Ply 500 und Ply 118 eigneten sich sehr gut zur Immobilisierung von Listeria-Zellen auf den super-paramagnetischen Dynabeads M-270 Epoxy. Generell konnten über 80 % der Zielzellen bei einer Zellkonzentration von ca. 104 KbE/100 μl wiedergefunden werden. Der Vergleich von CBD-magnetischer Separation (CBD-MS) und Ausplattierung auf Oxford-Agar mit der IDF-Standardmethode anhand von künstlich kontaminierten Lebensmitteln hat gezeigt, dass der Bead-Assay mindestens gleich gut, in den meisten Fällen sogar besser als die IDFStandardmethode abschneidet. Eine kombinierte Methode mit CBD-MS und Detektion über den rekombinanten Reporterphagen A511::luxAB konnte etabliert werden. Nach Adaptation an das Mikrotiterplattenformat und Optimierung der Messparameter wurden Zellkonzentrationen bis zu etwa 2 x 104 KbE pro Well detektiert. Diese Methode ermöglichte bei allen kontaminierten Lebensmitteln (außer Camembert) nach 24 h selektiver Anreicherung den Nachweis einer Listeria-Zellkonzentration von 100 KbE/g oder mehr. Die minimale Analysezeit betrug hierbei etwa 28 Std. Im Vergleich zur Referenzmethode entspricht dies einer Zeitersparnis von rund 2 Tagen. Eine Methodenvergleichsstudie der im Rahmen des Projektes entwickelten Methoden mit dem kulturellen Referenzverfahren und einem kommerziellen PCR-Verfahren wurde durchgeführt. Dabei wurden 173 dotierte Proben verschiedener in Abstimmung mit dem Projektbegleitenden Ausschuss ausgewählter Matrizes (Produktund Umfeldproben) sowie 103 native Proben vergleichend untersucht. Die im Rahmen des Projektes entwickelten Methoden zeigten ebenso wie das kommerzielle PCR-Verfahren eine gute bis sehr gute Übereinstimmung mit dem kulturellen Referenzverfahren.

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