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Erarbeitung von Grundlagen für die gezielte Entwicklung von Impfstoffen gegen die Afrikanische Schweinepest in Ost- und Süd-Afrika: Korrelation von Unterschieden der viralen Genomsequenzen mit der Virulenz sowie der Virus- und Wirtszell-Transkription und Proteinexpression (AVSOA)
Projekt
Förderkennzeichen: 2815DOKP21, FLI-IMVZ+IVD-08-Ri-0492
Laufzeit: 01.06.2016
- 31.10.2019
Fördersumme: 94.628 Euro
Forschungszweck: Angewandte Forschung
In vielen Ländern Afrikas ist die Bedeutung der Schweinehaltung für Ernährung und Wirtschaft während der letzten Jahrzehnte erheblich gestiegen. Diese Entwicklung wird jedoch durch verschiedene Tierseuchen gehemmt, unter denen die Afrikanische Schweinepest (ASP) besonders problematisch ist. Während die Infektion in Hausschweinen meist tödlich verläuft, verursacht das durch Lederzecken übertragene Virus der Afrikanischen Schweinepest (ASPV) in wildlebenden Warzen- und Pinselohrschweinen allenfalls milde Symptome und ist in diesen deshalb weit verbreitet, sodass es zur Neuübertragung auf Haustierbestände kommen kann. Obwohl Laborexperimente darauf hindeuten, dass eine Schutzimpfung gegen die ASP prinzipiell möglich sein sollte, ist es bislang nicht gelungen, einen praxistauglichen Impfstoff herzustellen. Da ASPV Isolate teilweise unterschiedliche Virulenz zeigen, sollen die vollständigen Genomsequenzen von derzeit in Afrika relevanten Viren verschiedener Genotypen verglichen werden. Repräsentative Isolate werden dann in Schweinen charakterisiert, sowie die entsprechenden Virus- und Wirtszell-Transkriptome und Proteome mittels „next generation sequencing“ und Massenspekrometrie untersucht. Hierdurch soll eine Korrelation zwischen genetischen Markern (Mutationen, die zur Deletion oder veränderter Expression viraler bzw. zellulärer Gene führen) und der Virulenz hergestellt werden. Um die biologische Relevanz der Genomunterschiede zu verifizieren, werden sie mittels gentechnischer Methoden in nahe verwandte Zellkultur-adaptierte ASPV Stämme eingeführt. Hierzu sollen Reportergene für fluoreszierende Proteine (z.B. GFP) oder andere selektierbare Marker transient in das ASPV Genom inseriert werden und auch neueste molekularbiologische Techniken wie die durch CRISPR/Cas (“clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease”) vermittelte Genommodifikation angewandt werden. Sobald isogene Gruppen aus virulenten parentalen ASP-Viren und Virus-Rekombinanten mit potentiellen Virulenzgen-Mutationen vorliegen, werden deren Vermehrung in vitro sowie deren Pathogenität in vivo vergleichend untersucht. Soweit möglich, soll eine Prüfung der Schutzwirkung durch Belastungsinfektion mit virulentem ASPV folgen. Die Auswertung wird die Quantifizierung klinischer Symptome und Mortalitäten, pathologische, virologische und serologische Parameter umfassen (Viruslast in Blut und Organen, Antikörperproduktion, Leukozyten-Differenzierung sowie Cytokin- und Chemokin-Induktion).
Im Rahmen des Projektes wurde vor allem ein virulentes ASPV Isolat aus Kenia (Genotyp IX) bearbeitet, welches sich nach einer kurzen Adaptationsphase auch sehr effizient in einer permanenten Wildschweinlungen-Zelllinie (WSL) vermehren lies. Vergleichende Genomsequenzanalysen des Ausgangsvirus und verschiedener Zellkultur-Passagen zeigten keine signifikanten Genomveränderungen. Basierend auf Virulenzstudien und Proteomanalysen anderer ASPV Stämme wurde versucht, mit Hilfe verbesserter revers genetischer Methoden verschiedene als Pathogenitätsfaktoren bekannte, sowie besonders abundant exprimierte Virusgene von ASPV-Kenia zu deletieren und die Auswirkungen auf dessen Vermehrbarkeit in Zellkultur zu untersuchen. Während die Deletion der Gene für die virale Ribonukleotid-Reduktase, das Membranprotein p12 und für pB119L (9GL) nicht zu vermehrungsfähigen Viren führte, konnten die viralen Thymidinkinase- und dUTPase-Gene, sowie die abundant exprimierten K145R und A104R Gene erfolgreich entfernt werden. Tierexperimentelle Untersuchungen müssen nun zeigen, ob diese Mutationen zur Entwicklung abgeschwächter Lebendvirus-Impfstoffe beitragen können. In einem alternativen Ansatz wurden WSL-Zelllinien hergestellt, die das CRISPR/Cas9 System mit spezifisch gegen ASPV Kenia gerichteten „guide RNAs“ stabil exprimierten. Da in diesen Zellen die Virusvermehrung stark gehemmt war, soll nun geprüft werden, ob auf diese Weise eventuell auch transgene, ASPV-resistente Schweine generiert werden können.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Tierhaltung
- Tiergesundheit
- Wildbiologie
- Biotechnologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
FLI - Institut für molekulare Virologie und Zellbiologie (FLI - IMVZ)
