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Entwicklung einer Methode zur Modifizierung des Apfelgenoms mittels CRISPR/Cas9-Technologie in Kombination mit Biolistik (CrispyApple)
Projekt
Förderkennzeichen: 031B0549
Laufzeit: 01.06.2018
- 31.05.2020
Fördersumme: 305.369 Euro
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
In diesem Projekt werden zwei innovative Methoden (CRISPR/Cas und Biolistik) kombiniert, um eine effektive Methode zur Modifikation des Apfelgenoms zu entwickeln. Eine derartige Methodik kann sowohl für die Forschung zur Entschlüsselung von Genfunktionen als auch für die Züchtung von Interesse sein. Es wird ein System zur transienten Transformation von Pflanzen entwickelt, indem Plasmide mit CRISPR/Cas-Konstrukten mit hoher Geschwindigkeit in Pflanzenzellen eingebracht werden. Nach deren Regeneration erhält man Pflanzen, welche transient mit CRISPR/Cas-Konstrukten transformiert sind, deren Expression zu genetischen Modifikationen führt, welche aber möglichst keine Fremd-DNA im Genom integriert haben. In DNA-freien Versuchsansätzen sollen Ribonukleoproteine (RNPs = Cas-Protein + “guide-RNA“) zum Einsatz kommen. Hierdurch wird das Risiko der Integration von Fremd-DNA ins Ziel-Genom eliminiert. Weiterhin sollen guide-RNAs und Cas-RNAs verwendet werden, um eine DNA-freie Genommodifikation zu erzielen und mögliche Limitierungen der Biolistik, bedingt durch die Proteingröße, zu vermeiden. Ausgangsmaterial für die Versuche sind in vitro-Kulturen von unterschiedlichen Apfelgenotypen. Diese Genotypen tragen ein Reportergen, dessen gezielte Inaktivierung durch den Verlust einer Farbreaktion leicht nachzuweisen ist. Durch drei verschiedene Herangehensweisen (mittels Plasmiden, mittels moderner RNPs und mittels RNAs) soll das Genom spezifisch modifiziert werden. Hierfür müssen entsprechende Vektoren konstruiert und spezifische und effektive guide-RNAs ermittelt und in-vitro produziert werden. Der Transfer mittels Biolistik muss durch Anpassung der physikalischen Parameter optimiert werden. Nach Regeneration der Pflanzen wird die gerichtete Genommodifikation durch Sequenzanalysen (PCR, Southern Blot, Sequenzierung, hochauflösende Schmelzkurvenanalysen, Heteroduplexanalysen mittels Kapillarelektrophorese) verifiziert.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Pflanzenzüchtung
- Obstbau
